ViaKrome 可固定活性染料染色协议

材料

• 磷酸盐缓冲液（PBS）
• 胎牛血清
• PerFix-nc 试剂 1、2 和 3（型号： B10825）
• 磷酸盐缓冲液（PBS）含 0.5% 甲醛

细胞系

1. 调整细胞系浓度为 5 x 10⁶/mL，每次测试使用 100 μL（每个测试 5 x 10⁵ 个细胞）
2. 添加 2.5 uL 的 ViaKrome 可固定活性染料
3. 涡旋
4. 在 18-25°C 下避光孵育 20 分钟
5. 添加 3 mL 的磷酸盐缓冲液（PBS） 1X
6. 在 300 g 下离心 5 分钟
7. 去除上清液
8. 加入 500 μL 的磷酸盐缓冲液（PBS） 1X / 甲醛 0.5%
9. 使用流式细胞仪获取数据

*对于与其他协议和/或样品一起使用，建议对 ViaKrome 可固定活性染料进行滴定实验，以确定最佳剂量。

使用 ViaKrome 可固定活性染料进行表面染色

未经处理（活细胞）和染色的Jurkat细胞（死细胞）的混合在一起上流式检测，结果用的双参数表示（侧向散射光强度与荧光强度）。使用 CytoFLEX LX N-V-B-Y-R-I 系列流式细胞仪进行数据采集，并通过特定的带通滤片检测发射光信号。ViaKrome 405 Dye 使用紫激光 （405 nm）激发，试剂组 A、ViaKrome 561 Dye 由黄绿色激光 （561 nm）激发、试剂组B、ViaKrome 638 Dye 由红色激光 （638 nm）激发、试剂组C 和 ViaKrome 808 由远红外激光 （808 nm）同时激发、试剂组 D。

外周血单核细胞 (PBMCs)

1. 在 50 μL 细胞浓度为107 /mL外周血单核细胞(PBMCs)中，加入 2.5 μL的 ViaKrome 可固定活性染料。
2. 涡旋
3. 在18-25°C下避光孵育20分钟
4. 添加 3 mL PBS 1X
5. 150 g 离心5分钟，吸除上清液
6. 加入50 μL胎牛血清，涡旋，直至颗粒分离
7. 继续进行细胞内染色

*对于与染色流程/或样品一起使用，建议对 ViaKrome 可固定活性染料进行滴定，以确定最佳剂量。

使用 ViaKrome 可固定活性染料进行表面染色

外周血单核细胞（PMBC）染色后上流式检测，结果用的双参数表示（侧向散射光强度与荧光强度）。使用 CytoFLEX LX N-V-B-Y-R-I 系列流式细胞仪进行数据采集，并通过特定的带通滤波器检测。ViaKrome 405 Dye 使用紫激光 （405 nm）激发，试剂组 A、ViaKrome 561 Dye 由黄绿色激光 （561 nm）激发、试剂组 B，ViaKrome 638 Dye 由红色激光 （638 nm）激发、试剂组 C 以及 ViaKrome 808 由红外激光 （808 nm）激发、试剂组 D 。