SPRIselect 磁珠试剂片段大小筛选方案

• 85% 非变性乙醇
• 用于DNA洗脱的水（分子生物学级）或标准缓冲溶液，如Tris（10 mM，pH 8.0）或TE（10 mM Tris，pH 8.1 mM EDTA）
• 磁力架或磁力板

• 样本应为片段化双链DNA。
• 样品应能够溶解至水（分子生物学级别）或标准缓冲溶液（如Tris或TE）。
• 样品体积应≥ 50 μL。过小的体积会降低SPRIselect试剂的移液精度,从而增加筛选位点的可变性。
• DNA产物片段大小筛选范围：150 bp-800 bp。
• 为最大限度地提高左侧片段大小筛选的回收率，样品片段最好分布于筛选点的右侧。
• 为了最大限度地提高右侧片段大小筛选的回收率，样品片段最好分布于筛选点的左侧。

通常，随着SPRIselect试剂与样本体积比例的增加，大片段核酸的结合率会逐渐降低。图 2 显示了这种关系。

图 2.（安捷伦高灵敏度 DNA 芯片）电泳图。 M = 高灵敏度 DNA 芯片的上下标记。Shear = 1 μL of 20 ng/μL 起始对照样品水溶液。 1.2x - 0.4x = 1 μL 的 shear, 根据SPRIselect 试剂体积和样本体积的比率筛选片段大小。

1. 充分振摇 SPRIselect瓶，确保 SPRI 磁珠重悬。参考图2中片段分布与磁珠加入体积比的关系，移取适当体积的SPRIselect试剂，加入样本中。

   提示: 样品体积×右侧筛选试剂比例= SPRIselect 试剂加入体积。
   例如：50 μL 样品× 0.7 x ratio = 35 μL SPRIselect 试剂。

2. 使用移液器反复吹打10次，确保充分混匀，并在室温下孵育1分钟
   或者
   以适当的速度涡旋1分钟，直至充分混合（具体时间取决于实验耗材和总体积）。

   注意： 样品和SPRIselect试剂未充分混匀将导致片段大小筛选结果不一致。请务必确保样品和试剂混匀。

3. 将反应容器置于适当的磁力架或磁力板上，以便让SPRI磁珠吸附至磁力板（架）。吸附时间会有所不同 – 较大样品起始量、较高 SPRIselect 比率或磁性较弱的磁体则需更长的吸附时间。

4. 将含有右侧片段大小筛选样品的澄清上清液转移至新反应容器。可以废弃带有残留磁珠的反应容器。

   注意: 在该步骤中，应注意不要吸取超痕量磁珠，最终的文库需要满足一定的长度大小，大量磁珠转移将导致拖尾进入更大的片段大小范围。

5. 使用以下计算方法将SPRIselect试剂按所需体积添加至上述步骤4的上清液中，从而将上清液中的核酸片段与新的SPRI磁珠结合。

   提示： 样品体积 μL ×（1.8 – 初始ratio）= SPRIselect 试剂体积。
   例如：50 μL ×（1.8 – 0.7）= 55 μL SPRIselect 试剂。

6. 执行以下操作步骤：

   • 使用移液器吸头反复吹打10次，确保试剂和样品充分混匀，并在室温下孵育1分钟
     或者
     以适当的速度涡旋1分钟，直至充分混匀（具体时间取决于实验耗材和总体积）。

     注意：样品和SPRIselect试剂未充分混匀将导致片段大小筛选结果不一致。

   • 将反应容器置于适当磁力架或磁力板上，将SPRI磁珠吸附至磁体。吸附时间长短不等，较高起始样品量、较高 SPRIselect 比率或磁性较弱的磁体则需更长的吸附时间。

   • 取出并废弃已澄清的上清液。

     注意： 在此步骤中，应注意不要吸取超痕量磁珠，因为所需构建的文库的片段大小与磁珠关联。大量的磁珠损耗将导致产量降低。

7. 当反应容器仍置于磁力架铁上时，加入 180 μL 85% 乙醇（非变性）并在室温下孵育 30 秒。吸取并废弃乙醇上清液。

   注意： 在此步骤中，应注意不要吸取超痕量磁珠，因为所需构建的文库的片段大小与磁珠关联。大量的磁珠损耗将导致产量降低。

8. 洗脱样品步骤：

   • 从磁力架上取出反应容器，加入 ≥20 μL 分子生物学级水或标准缓冲溶液，如 Tris 或 TE。

     注意: 洗脱体积应充足，以使液面足够高，确保磁珠完全吸附至磁体。

   • 确保充分混合总洗脱体积以重悬磁珠，在室温下孵育 1 分钟
     或者
     以适当的速度涡旋1分钟，直至充分混匀（具体时间取决于实验耗材和总体积）。

   • 将反应容器放在适当的磁力架或磁力板上，让SPRI磁珠吸附至磁体。吸附时长会有所不同，较大的洗脱体积或磁性较弱的磁体则需更长的吸附时间。

9. 将洗脱液（已筛选片段大小的样品）转移至适当储存容器。