分析型超速离心技术（AUC）在脂质纳米颗粒（LNP）表征中的应用综述

介绍

脂质纳米颗粒（LNP）和脂质体（图 1）作为多种治疗分子的递送载体，在医学领域展现出多维度突破性应用，已成功应用于癌症治疗、药物递送及疫苗开发，如 Moderna 和 Pfizer-BioNTech 推出的 COVID-19 mRNA 疫苗。由于 mRNA 具有免疫原性和毒性，且易被患者体内的核糖核酸酶（RNase）降解及肾脏过滤清除，因此不能以直接给药的方式注射至患者体内；1但通过将其包裹在脂质纳米颗粒（LNP）中，可成功克服上述问题。LNP 还可增强包裹药物的稳定性、实现靶向递送以及快速适配变异毒株等额外优势。2

LNP 的生物物理表征结果对其质量、功效和安全性评估至关重要。精准测定 LNP 制剂的粒径和均一性尤为关键，最新模型研究表明，这些参数直接影响治疗的免疫原性和效力。3 然而，LNP 制剂固有的异质性阻碍了粒径分布的精准测定。虽然动态光散射（DLS）是常用的粒径检测方法，但基于布朗运动的测量原理，其检测上限存在一定的局限性，可能导致聚集体漏检。4此外，DLS 检测法无法有效区分空壳和载药颗粒。为解决这一技术局限，美国 FDA 建议采用正交检测技术来验证表征结果。5 其他需表征的重要参数包括：游离载药和载体结合药物/包封药物、药物拷贝数分布、纳米颗粒的空载/满载比例（包封率）及其稳定性。

Ionizable neutral lipid  可电离中性脂质
Ionizable cationic lipid  可电离阳离子脂质
´Helper´ lipid  “辅助”脂质
 Cholesterol 胆固醇
PEG-lipid  PEG 脂质（聚乙二醇脂质）
Nucleid acid (e.g. mRNA)  核酸（如 mRNA）

图 1：脂质纳米颗粒（LNP）是医药和生物技术领域用于优化药物递送的纳米颗粒，其核心结构由脂质构成，能够有效包裹和保护核酸或其他治疗性药物分子，从而提升稳定性、细胞靶向性并增强药物效能。

分析型超速离心（AUC）技术是生物制药、疫苗研发等领域的重要工具，尤其在 LNP（脂质纳米颗粒）表征领域的应用日益广泛。在离心过程中，样品会基于其沉降系数（取决于分析物质量和密度）和扩散系数（取决于颗粒形状）发生流体力学分离。对于脂质纳米颗粒（LNP），其分离过程中的沉降或漂浮（图2），主要取决于脂质组分和载药量。通过实时追踪分析物在离心场中的光吸收特性，可测定其沉降/漂浮及扩散的动力学模式。基于测定的沉降和扩散系数，可进一步解析此类复杂体系的粒径分布、载药情况、摩尔质量等关键参数。

本文将探讨分析型超速离心（AUC）技术在脂质纳米颗粒（LNP）表征中的应用，并与其他分析方法进行对比。此外，现有研究表明，离心过程中产生的重力场似乎不会对 LNP 的结构或功能造成显著影响，反之，若存在此类影响，在分析过程中应能被精准识别。6

A)

Depicts a sedimenting particle

B)

Depicts a particle that floats during the centrifugation process

图 2：通过分析型超速离心机（AUC）收集的沉降和漂浮数据示例：AUC 离心过程中颗粒边界形状示例。Scan 图谱中的曲线颜色按扫描时间顺序编码，依次为紫色（最早）、蓝色（中期）和绿色（最新）。A）沉降颗粒的运动轨迹。B）离心过程中漂浮颗粒的运动轨迹。

一些研究使用分析型超速离心（AUC）技术来测定不同 LNP 制剂的粒径和粒径分布情况，包括 siRNA，mRNA 和阿霉素包封系统。5–7这些研究将 AUC 技术与其他技术在 LNP 平均粒径和粒径分布的检测结果进行比较研究，其他技术包括动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和非对称流场流分离（AF4）与多角度光散射（MALS）。 研究发现，通过分析型超速离心（AUC）测定的平均粒径与其他所有测试方法的检测结果高度一致。值得注意的是，AUC 能精确测定所有 LNP 制剂的粒径分布，该结果与非对称流场流分离-多角度光散射联用技术（AF4-MALS）和冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）技术的测定数据一致。AF4-MALS 在检测含有多分散性和高分子量物质的样品时，AF4-MALS 与 AUC 技术均展现出高分辨率检测优势5,8 （图 3），这得益于两种技术均结合了分离技术与实时在线监测能力。AUC 还额外增加了基于粒径和密度的双重分离维度，从而为 LNP 样品提供更精准的粒径分布测定结果。

此外，分析型超速离心（AUC）技术已被用于测定制剂中游离态与结合态载药的比例6,7 ，这一关键参数直接影响治疗安全性，因为游离载药可能引发毒性并增强免疫反应。9 Optima AUC 分析型超速离心机配备多波长光源系统，可在单次实验中实现 180-900 nm 范围内多达 20 个波长的同步检测。该技术能够实时监测制剂中不同载药的吸光度特性（如核酸在 240 nm 波长处，而阿霉素脂质体 Doxil 在 380 nm 波长处）。虽然 LNP 本身也可被检测，但由于脂质不吸收光，实际测得的是 LNP 产生的散射光信号，其有效检测范围通常在 215-280 nm 之间，具体取决于 LNP 的粒径。应注意：LNP 散射光信号的强度变化规律与载药的光吸收信号存在本质差异。6 通过在整个实验过程中测定的样品沉降和扩散系数，Mehn 等研究人员计算出了游离态药物的含量，其结果与 HPLC 和 DLS 技术的测定结果高度一致。7 Henrickson 等研究人员利用多波长与荧光检测技术证实其 siRNA LNP 仅含包封 RNA。6

A) 基于动态光散射（DLS）技术的批检测结果

Immagine 1

B) 基于多角度动态光散射（MADLS）技术的检测结果

Immagine 1

C) 基于纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术的批检测结果

Immagine 1

D) 基于分析型超速离心（AUC）技术的检测结果

Immagine 1

图 3：LNP 制剂的流体力学粒径：通过A）动态光散射（DLS）批检测、B）多角度动态光散射（MADLS）检测、C）纳米颗粒跟踪分析（NTA）批检测以及 D）分析型超速离心（AUC）技术测定的四种不同 LNP 制剂的流体力学粒径。有关图中参考颜色的更多信息和解释，请参阅 https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/38253203/ Parot et al. DOI: 10.1016/j.jconrel.2024.01.037, Epub 2024, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, image was not altered. 转载图片源文件，未作任何修改。

目前，尚不明确空载脂质纳米颗粒（LNP）在药物治疗过程中（若被使用）可能发挥的作用，但对其表征的研究有助于优化 LNP 生产工艺并确保治疗安全性。通过密度匹配分析超速离心技术（AUC），即在不同密度的缓冲液中多次测量同一样品，可测定样品的整体密度分布情况，获得该数据后，可将其与空载 LNP 样品的密度分布进行比较。若两者密度分布存在重叠区域，则表明该样品中可能含有一定比例的空载 LNP。5–7 Bepperling 和 Richter 基于该方法构建实验并计算出每个衣壳的 mRNA 拷贝数。10他们发现其 mRNA LNP 制剂的流体力学半径分布范围在 25 – 100 nm 之间，且每个衣壳包裹 1 – 10 个 mRNA 拷贝数。他们确定该个位数值的载药量与其粒径分布相匹配，且与同类 LNP 体系的研究数据一致。11–13 这些研究充分证实了分析型超速离心（AUC）技术在空壳 LNP 和组装完整的 LNP 分布及 mRNA 载荷定量表征方面的优势。这两项关键参数将直接影响细胞活性与 mRNA 表达动力学特征，12 对其精确测定不仅有助于优化 LNP 生产工艺，还能推动更广泛治疗药物的递送系统开发。需注意的是，在实际应用场景下（如冻融循环或室温操作等条件），必须通过多时间点监测来系统性评估 LNP 制剂的稳定性。9 Thaller 等研究人员对分析型超速离心（AUC）技术和动态光散射（DLS）在表征不同应力条件下 LNP 的多分散性和稳定性进行了比较。8DLS 技术可定性检测颗粒的流体力学半径，并识别暴露于冻融循环或室温条件下，颗粒在制剂中的变化以及在 50°C 条件下的机械应力（非热应力）。经研究验证，AUC 是一种卓越的 LNP 定量表征方法，可提供更精准的粒径分布结果，识别出颗粒在所有测试应力条件下的变化，并观察到使用 DLS 技术无法测定的颗粒密度变化。

这些研究强调了分析型超速离心（AUC）技术在表征 LNP 制剂领域的多功能性和实用性。AUC 可精准测定 LNP 制剂的粒径分布，且与非对称流场流分离-多角度光散射联用技术（AF4-MALS）和透射电子显微镜（TEM）技术的检测结果高度一致。此外，该方法还可成功识别和量化溶液中存在的游离载药和 空壳 LNP，并可用于确定每个 LNP 的 mRNA 拷贝数。总体而言，AUC 是一种无损的定量第一性原理方法，为 LNP 的表征提供了全面可靠的检测方法，已成为 LNP 研究中不可或缺的利器。

引用和参考文献

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