库尔特原理分析细胞
测量既高速又准确
前言
20 世纪 40 年代末，就职于美国海军的华莱士·H·库尔特发明了一种细胞计数和粒径检测方法。该方法主要用来快速准确地统计血液细胞。它在血液学领域被广泛应用，目前超过 98% 的自动化细胞计数仪都在应用库尔特原理. 在过去 50 年里，该方法还用来表征成千上万种不同的生物和工业材料。细菌、酵母细胞、药物、色素、调色剂、食品、研磨料、炸药、粘土、矿物、金属和许多其他材料均在使用库尔特原理分析。这种方法可用来测量任何可悬浮于电解液中的颗粒物质。该方法已被编写为国际标准ISO 13319，同时还被多个 ASTM 标准所引用。超过 7000 多篇文献记载了各类库尔特计数器 COULTER COUNTER 模型
库尔特原理
如何进行细胞粒径分析和计数
库尔特原理是对悬浮于导电液体（电解液）中的颗粒或细胞，在它们穿过小孔时所产生电阻变化的测量。颗粒或细胞悬浮于导电液体中时，它们可起到离散绝缘体的作用。稀释悬浮的颗粒通过圆柱状小孔时，位于小孔两侧电极片之间的电阻在遇到细胞通过小孔时而变化，从而产生电脉冲。图 1 展示了单个细胞穿过小孔时的路径。
电脉冲的数目可用于细胞计数，而产生的电脉冲振幅取决于细胞体积。电极片之间的有效电阻即小孔内外的导电液体电阻。小孔内细胞的出现会增大导电平面的电阻，而电阻增量则取决于细胞体积。对小孔内细胞运动路径进行的理论和实际分析表明，细胞产生的电脉冲高度显示出几乎总是与细胞体积成比例的特点（Eckhoff 1967, Grover等 1972, Waterman等 1975, Kachel等 1976, Harfield等 1984）。使用这种方法，可以在一定的粒径范围内，通过细胞产生的脉冲信号，统计细胞的数量。
库尔特原理在 Multisizer 4e 库尔特颗粒计数及粒度分析仪中的应用
图 1. 库尔特计数和粒度分析原理
细胞大小为何重要
研究细胞粒径大小分布可以获得大量有价值的相关信息：药物对组织培养细胞生长的影响、细菌生长速率、细胞大小随年龄的变化，以及许多其他生物医学相关主题。
细胞体积会在许多生物过程中发生变化，如：
- 细胞增殖与细胞周期
- 细胞死亡
- 渗透压补偿
- 发病机理
- 内吞作用&吞噬作用
比如，培养液中增殖的细胞在每次分裂前其体积往往成倍增大，但目前尚未知悉生长率和分裂率如何协调才能确保细胞大小得到维持。测量细胞体积变化的能力，被证明为一种了解和控制细胞生长和细胞周期的重要工具。
此外，维持足够数量的细胞需要在细胞增殖和细胞死亡之间保持微妙的平衡。这种平衡允许最大限度地适应不断变化的功能需求。细胞死亡可能通过至少两种不同的机制完成，即坏死和凋亡。坏死是一种病理生理机制，涉及细胞肿胀、细胞膜破裂、胞内物质释放。凋亡是一种程序性细胞死亡机制。凋亡的特点之一是细胞收缩。包括癌症在内的许多疾病模型都被假设是由于平衡细胞增殖和凋亡的精妙方式发生失衡和功能失调而引起的。
库尔特原理是研究细胞大小最普遍适用的技术之一。本指南中，我们指出了一些采用库尔特原理的方法，同时也提供了一些典型实例。
生物细胞测量指南
以下各页介绍几种不同的细胞大小测量方法，可用于各种细胞类型。向读者提供了缓冲液和稀释液制备的注意事项以及细胞大小分布曲线。这些数据显示，库尔特原理为研究许多生物特征各异的生物体细胞大小分布提供了必需的灵敏度、准确度和灵活性。
细菌
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
| MS4e 使用 10 或 20 um |
Isoton II |
对于细菌研究，电解质本底必须尽可能低，这一点非常重要。如果细菌产生自己的电解质，在过滤前必须添加少量合适的抑菌剂，如0.1% 的叠氮化钠。 一般而言，在最低可用仪器设置下，可接受的本底计数约为总细胞计数的 1–2%。 |
在电解液中为1:10,000 |
图 2. 以浓度（每毫升计数）表示的金黄色葡萄球菌细胞培养液示例。细胞大小的中位直径为 0.991 微米。
图 3 . 以浓度（每毫升计数）表示的大肠杆菌细胞培养液示例。细胞大小的中位直径为 1.059 微米。
霉菌
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
MS4e 采用 20 um孔道 Z 系列采用 50 um |
Isoton II、 0.9% NaCl 或2% NaCL 以 0.22 um的膜过滤器过滤。 |
以 0.22 um的膜过滤器过滤电解质。 |
在电解液中为1:400 |
图 4. 以总细胞计数表示的曲霉菌示例。注意，1um以下大量的颗粒计数可能是由亚细胞碎片所产生。
图 5. 对图 8 中 1.6 – 5 um范围曲霉菌图像的放大视图。
全血细胞
| Aperture Size (s) |
Electrolyte(s) |
Preparation Notes |
Dilution |
|
Multisizer use 70 µm Z Series use 100 µm |
Isoton II |
Filter electrolyte through 0.22 µm membrane filter |
1:150,000 in Isoton II |
图 6. 以细胞浓度形式展示的1号献血者的全血示例。注意，两个峰分别表示全血钟不同的细胞亚群。
图 7. 2号献血者全血示例。
图 8 . 1号和2号献血者的重叠图。
白细胞
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer使用 70um Z 系列使用 100 um |
Isoton II |
分析全血中的白细胞时，选择合适的裂解液才能获得相应的准确度。 在本示例中，VersaLyse*用作裂解剂。 步骤：
* VersaLyse 为贝克曼库尔特生产的裂解剂 |
在 Isoton II 中为 1:500 |
图 9. 已裂解全血的白细胞示例。注意，5 微米附近的大峰表示这种处理过的样品中红细胞已经消失。
图 10. 全血样品与裂解后的白细胞样品重叠图。
线粒体
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer 使用 10 µm |
Isoton II 以 0.22um的膜过滤器过滤电解质。 |
线粒体样品加至电解质溶液中前无需稀释。将 10、50 或 100 um线粒体样品转移到装有 20 mL Isoton II 的 Accuvette 瓶中已足够。 因为线粒体的直径很小，必须使用 10 um小孔管。每次使用后彻底清洗小孔管极其重要。经常清洗可以降低小孔管堵塞的几率。可以将小孔管泡在加热板上装满水的烧杯中会很有用的。 |
无 |
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指南提供者： Preble, Janine M 美国马萨诸塞州波士顿市贝斯以色列女执事医疗中心和哈佛医学院心胸外科 |
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图 11. 两种不同浓度线粒体的样品粒径大小分布重叠图。
Mammalian and Insect Cells
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer采用 70 um Z 系列采用50 um |
Isoton II 细胞培养基 细胞培养稀释缓冲液 |
使用可反映研究或储藏条件下的细胞培养环境的电解质溶液。这将防止意外的细胞肿胀或收缩。 库尔特计数器采用库尔特原理，可以通过改变悬浮液的组成和分析一系列组成的相关数据，研究胞外溶质的影响。这种方法可用于监测细胞体积随时间的变化。 |
在测量容器中适当稀释以获得 5-10%的样品浓度 |
图 12. U937 昆虫细胞系示例。
图 13. CHO 细胞系示例。注意，细胞体积与上文所示的U937 细胞系相似，但有明显的定义差异。
酵母细胞
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer采用 30 或 20 um |
Isoton II |
以 0.22um 的膜过滤器过滤电解质。 |
在测量容器中适当稀释以获得5-10% 的样品浓度 |
图 14. 假丝酵母细胞体积分布示例。
图 15. 假丝酵母细胞直径大小分布示例。
真核藻类
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer采用 70 um |
Isoton II 海水 |
无需特殊制备 | 在测量容器中适当稀释以获得 5-10%样品浓度。 |
图 16. 同步培养绿藻细胞的两个亚群。
参考文献：
Multisizer Series Applications: On-Board Research Ships Studying Algae and Cyanobacteria.
Ondrej Prášil and Katerina Bišová,
Department of Phototrophic Microorganisms – Algatech Institute of Microbiology,
Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.
Antoine Sciandra
Laboratoire d’Océanographie de Villefranche, Station Zoologique, Villefranche-sur-Mer, France
Beckman Coulter Application Note B2013-14236
三倍体或双倍体鱼的鉴定
三倍体鱼的平均红细胞体积、细胞核体积、线性测量结果和DNA含量均比双倍体鱼大 1.2 - 1.8 倍，各测量间几乎没有重叠。采用库尔特计数器测量平均细胞核体积，提供了快速准确区别双倍体鱼和三倍体鱼的方法。
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
|
Multisizer采用 50um |
Isoton II |
无需特殊制备 | 在测量容器中适当稀释以获得 5-10% 的样品浓度。 |
图 17. 同步培养绿藻细胞的两个亚群。
参考文献：
Verification of the production of triploid grass carp (Ctenopharyngodon idella) with hydrostatic pressure.
Nigel H. McCarter. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 1988, Vol. 22: 501-505
The physiological response of diploid and triploid brook trout to exhaustive exercise. C.A. Hyndman et al.
Comparative Biochemistry and Physiology Part A 134 (2003) 167–179
人和猪心肌球细胞
| 小孔管孔径 |
电解液 |
制备说明 |
样品稀释 |
| Multisizer采用 560 um |
Isoton II |
在 400 mL样品容器中搅拌样品，使细胞悬浮，然后测量 |
在测量容器中适当稀释以获得 5-10% 的样品浓度。 |
图 18. 人和猪心肌球细胞群差异示例。注意 200-300 um之间的大聚合值。
为了确保获得测量的准确度和精确度，可遵循若干最佳做法。在本节中，我们描述了关于实验规划时应予以考虑的关键点。
确保测量准确性
使用大小合适的小孔管
最合适小孔管大小的选择取决于待测量的细胞。如果样品中的细胞大部分位于 40:1 直径尺寸范围内，那么就可以选择最合适的小孔管。比如，Multisizer 4e 上的 100 um小孔管可以测量直径为 2-80 um的细胞；140um小孔管可以测量直径为 2.8-112 um的细胞。
如果细胞群具有异质性特点，涵盖单个小孔管无法测量的较大范围，建议使用测试结果重叠的两个或更多小孔管，以提供完整的细胞大小分布分析。
使用较小的小孔管时应注意，由于样品悬浮液中的碎片或样品颗粒本身团聚，这些孔道更容易堵塞。如果使用库尔特计数器，小孔受到监控，可轻易发现其中的任何堵塞。通过对小孔施加瞬时反压，或使用软刷，一般很容易清除堵塞。如果上述方法无法清除堵塞，可从系统取下小孔管，并将其泡在酸液中或施加更大负压。使用小的小孔管时，必须特别小心高电流，因为高电流会破坏小孔。
使用合适的电解液
选择用于颗粒悬浮的电解液时应考虑到几个方面。电解液应与样品材料化学兼容，并应允许样品适当分散。可能有必要经常使用表面活性剂和超声波降解法处理。在待测颗粒大小范围内，电解液中不应存在杂质颗粒。一般使用 0.22 或 0.45 um滤膜过滤电解液。
溶液的导电特性应与 0.2-20% w/v 氯化钠水溶液相似。在溶液中测定的小孔电阻应为1-100 kΩ，最佳值为5-40 kΩ左右。因为库尔特原理最初用于血细胞计数，所以最常用的电解质是生理盐水（0.9g NaCl/100ml水）。贝克曼库尔特 Isoton II 稀释液是一种过滤的磷酸盐缓冲生理盐水，与人血细胞兼容，极力推荐用作大多数生物细胞和许多工业样品的悬浮液。
如前所述，库尔特原理可用于可悬浮在电解液中的任何细胞或颗粒的计数和粒径分析。为了悬浮一些大颗粒，可能有必要添加增稠剂，如甘油或蔗糖，以增加电解液的粘度。增稠剂还有助于降低低粘度电解液流经大直径小孔（直径≥ 560 um）时其湍流产生的噪音。即便尽力搅拌并使用增稠剂，大颗粒也未必均匀地分布于悬浮液中，使得代表性样品获得可重现的计数结果。由于颗粒悬浮问题，圆底烧瓶实际上已经替代平底烧瓶成为库尔特原理的首选容器。圆底烧瓶可使整个悬浮液中的颗粒更均匀地分布，从而产生更一致的测量结果。
使用小孔管时，有必要预先过滤去离子水和/或 Isoton II，用于Fill、Flush或清洗整个系统和配件。使用兼容的 0.2 um过滤器过滤 Isoton II 或电解液。0.1 um过滤器还可以与 0.2 um过滤器串联使用，以增大过滤范围。如需确定适合你应用的过滤器组件，请联系过滤器供应商。
小孔管校准
库尔特计数器提供两种基本测量结果，即细胞计数和细胞体积。细胞计数不需要校准。经过重合校正，原理将产生准确的细胞计数。然而，细胞大小响应必须校准。
使用标样（如聚合物乳液样品）进行校准。可从贝克曼库尔特公司获取 NIST 可溯源校准标准品。这些是大小范围狭窄的乳液样品，其大小已经使用另外一种方法精确测定，而且它们已作标准化处理以获得峰值。标样测试后，所产生的粒径大小分布与乳液的标定值相关。
使用合适的样品浓度
为了获得最大的测量精度，必须考虑到两个可能相互矛盾的因素。第一，所计数颗粒的总数量必须足够高；第二，颗粒浓度不得超过Coincidence限度。当一个以上的颗粒或细胞同时通过小孔管感测区时，将出现Coincidence现象。换言之，理想的计数条件是颗粒浓度低、测量体积大。未稀释样品一般不具备这些条件。然而，重要的是任何颗粒计数器/粒度分析仪都应可测量大量颗粒，以获得结果的最大统计置信度。如果无法累计大量的颗粒计数（即不超过 100 个细胞），建议进行3次分析，并取3次分析的平均值。
结论
不管你的细胞是细菌、动物细胞还是浮游生物，毫无疑问，库尔特原理都是研究细胞大小或仅用于细胞计数的最普遍适用的技术之一。它可追溯至二十世纪四十年代，是一项公认的、稳定的技术。
其他信息
如欲了解关于库尔特计数器的更多信息，请参阅贝克曼库尔特生命科学网站上的库尔特计数器短期课程和各种操作说明书。
作者
Matthew Rhyner （哲学博士），Giovanni Prestigiacomo，Kapil Kumar （哲学博士）和 Lena Lee
