BioLector XT微型生物反应器小球藻光营养培养

前言

随着现代生物过程工程技术的快速发展，科学家们能够利用这些先进技术充分挖掘微藻在生产生物能源及有价值化合物的潜能1。近期掀起的藻类生物技术热潮，大幅推动了微藻类在生物燃料生产、二氧化碳封存和环境生物修复中的应用，成功揭示了藻类可作为生物质能源以及食品、营养制剂和药物来源的巨大潜力2。

此外，将藻类用作微生物细胞工厂，为全球最紧迫的粮食和能源等危机带来一线生机3，并将持续推动可持续生物经济的转型加速4。虽然微藻价值链在工业规模化生产中会给企业带来潜在利润和竞争力，但生物精炼工厂需根据生物潜力、工艺路线和市场需求进行调整5,6。

培养条件优化、藻株筛选和藻株工程是商业化的三大关键步骤7，如通过缩短叶绿素天线尺寸，以最大限度地提高太阳能-产物能量转换效率8。基于微孔的培养设备为微生物和哺乳动物细胞早期快速筛选提供了一种强大的工具9，并已成功应用于异养微藻生物工艺开发10。

微型光照生物反应器（µPBR）系统，可用于研究自养或混合营养培养条件，但目前的概念离系列技术还很远，进一步的改进——尤其是可调节照明——是必要的11,12。

在本《应用指南》中，搭载精密光照模块的 BioLector XT微型生物反应器 ，可在多达48个微孔中同时进行光营养培养。通过专门设计的滤光片模块，可实现非侵入式、实时在线监测关键培养参数如生物量、叶绿素浓度和pH值。光照模块（LAM）在光合光谱范围内提供精确、多样化的光照方案。其光谱的灵活性是通过16种不同的LED实现的，每一个LED都可以单独控制，可提供近4000 μmol/m2/s的最大辐射。

biolector microbioreactor with lam module

图 1. 搭载LAM的BioLector XT高通量微型生物反应器

作为市场上的优势微藻属之一，小球藻（Chlorella vulgaris）可在光养、异养和混养条件下进行培养13。每年约生产5000吨生物量14。小球藻在多种培养条件下生长迅速，大量研究已揭示小球藻所产生的生化成分的许多应用15。小球藻的蛋白质含量高，其氨基酸谱与世界卫生组织（WHO）推荐的人类营养素相当，而且它含有人体必需的营养素，因此广泛应用于食品和饲料工业领域15。此外，小球藻在不利的生长条件下可积累C16和C18脂肪酸16,17，为污水处理厂生产生物燃料提供了可能性。15

Chlorella vulgaris

图2. 小球藻在BioLector XT高通量微型生物反应器中的光自养培养

在本《应用指南》中，我们将为您展示搭载LAM的BioLector XT高通量微型生物反应器，非常适用于小球藻的光自养培养。此外，经专门设计和验证的滤光片模块，支持在线监测多种关键培养参数。

方法

滤光片模块开发

经专门设计并测试的滤光片模块，可用于在线监测多种重要的光营养培养参数。

生物量：利用散射光测定生物量18，滤光片模块的光谱范围在叶绿素吸收光谱（>700 nm）之外，可避免色素干扰19。这些滤光片模块已基于小球藻系列稀释液进行校准。

叶绿素含量：利用叶绿素荧光在线定量叶绿素浓度。为此，将叶绿素a和叶绿素b标准品（Sigma-Aldrich）溶于DMSO，并使用叶绿素a和叶绿素b系列稀释液测试上述滤光片模块。此外，基于生物量对叶绿素荧光进行了校准。

pH值：由于optode20传感器对光漂白较为敏感，因此在连续照明条件下无法使用optode传感器测量pH。作为替代方法，使用可溶性荧光pH指示剂8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (HPTS) 进行pH测定21,22。由于需通过HPTS测定pH的比率性质，因此，对pH专门设计的两个模块需同时安装。

在405 nm和455 nm激发波长下，HPTS具有pH依赖性荧光强度，发射波长为520 nm。强度比IR（公式1）在pH 0~14范围内稳定21，但如果未事先校准则无法计算pH值22。将校准结果拟合到Boltzmann方程，可以计算校准参数pH0、dpH、IR,min和IR,max（公式2）23。

Boltzmann equation biolector 

利用经专门设计的滤光片模块，绘制校准曲线，评估在BioLector XT微型生物反应器中通过HPTS测定pH的可能性。此外，在典型的光营养培养条件下，测试该方法对光漂白的敏感性。

小球藻

无菌小球藻（SAG藻株编号211-11b）由哥廷根大学藻种保藏中心提供。

培养基

在pH值为6.5的改良Bold基础培养基（enBBM）中进行培养24-27。

培养基由9.76g/L MES缓冲液、1.5g/L NaNO3、0.6g/L K2HPO4、1.4g/L KH2PO4、187.5mg/L MgSO4·7H2O、6.25mg/L NaCl、125mg/L CaCl2·2H2O、9.96mg/L FeSO4·7H2O、3.68mg/L H2SO4、100mg/L Na2EDTA·2H2O、62mg/L KOH、10mg/L sodium penicillin-G和20mL/L微量元素溶液组成。

微量元素溶液的组成如下：17.64mg/L ZnSO4·7H2O、2.88mg/L MnCl2·4H2O、2.4mg/L Na2MoO4·2H2O、 3.14mg/L CuSO4·5H2O、0.94mg/L CoSO4·7H2O以及22.8mg/L H3BO3。

在BioLector XT微型生物反应器中进行培养时，将HPTS原液添加至培养基，使其最终浓度为0.1 mg/L HPTS。

在摇瓶中预培养

将小球藻置入振幅为50mm的摇瓶中，在25℃培养箱中以180 rpm振速进行预培养。为实现光营养生长，在培养室的一侧安装LED模块，同时在摇瓶口使用棉塞，方便气体出入培养液。LED模块由8个平行安装的模拟太阳光LED 灯条组成（LUMITRONIX LED-Technik GmbH）。将辐照度设置为200 μmol/m2/s，使之与BioLector XT微型生物反应器培养时的辐照度一致。

在BioLector XT微型生物反应器中培养

采用Flowerplate微孔板[M2P-MTP-48-B，m2p-labs（现为贝克曼库尔特生命科学旗下公司）28]进行光营养培养，初始细胞密度为5.5*106个细胞/mL，培养体积为1 mL。用透气性密封膜（MTP-F-GPRS-48-10）密封微孔板，方便光合作用期间二氧化碳和氧气的交换。照明模块设置为提供400 ~ 700 nm的类太阳光谱，光子通量密度约为200 μmol/m2/s（图3）。

Illumination spectrum and irradiance
图3. 培养期间的照明光谱和辐照度

将培养参数设置为800 rpm、25℃和85% 的相对湿度，并按10 mL/min流速充入空气和 2% 的CO2混合物。

结果

滤光片模块校准

生物量：经专门开发的730、750和850 nm生物量滤光片模块，可在0.3≦OD750≦25范围内显示出卓越的校准效果，730 nm模块校准结果如图4所示。此外，叶绿素a和叶绿素b标准品均未检测到叶绿素干扰。

Calibration of a 730 nm scattered light filter module
图4. 基于小球藻系列稀释液校准730 nm散射光滤光片模块

叶绿素含量：叶绿素校准结果显示，经专门设计的滤光片模块可单独或同时检测叶绿素a和叶绿素b（图5）。

Chlorophyll concentration
图5. 基于叶绿素a（黑色）和叶绿素b（红色）系列稀释液校准叶绿素荧光滤光片模块

叶绿素荧光常用于测定光营养培养物的生物量29,30。因此，使用生物量系列稀释液进行校准，应用指数递减拟合时，在低生物量浓度下可观察到极佳的分辨率（图6）。

Calibration of the chlorophyll filter module
图6. 基于OD750 最大值为2的生物量校准叶绿素滤光片模块（λex = 450 nm；λem = 700 nm）

校准结果证实，叶绿素荧光滤光片器可准确测定生物量浓度，特别是在生物量浓度较低的时候。

pH值：分别在25、30、35和40℃下，使用含0.1 mg/L HPTS的pH 5~10缓冲溶液（Merck, Darmstadt, DE）对pH滤光片模块进行校准。校准结果出色（图7），证明所该设置适用于在线准确测定pH值。

Calibration of intensity ratio
图7. 基于pH校准强度比IR，拟合Boltzmann方程曲线

为确保拟定方法对光漂白不敏感，我们在BioLector XT微型生物反应器中使用无接种物enBBM在200µmol/m2/s典型培养条件进行培养实验（图8）

Optical pH determination with HPTS
图8. 在培养条件下使用HPTS进行一式三孔pH光学测定

实验开始后，CO2浓度的增加使培养基迅速酸化（~0.05 pH），但在之后的130小时内，测量值（图8）始终保持恒定。这一点证明，在连续光照的培养条件下，使用HPTS测定pH，可连续多日保持准确、稳定的测量水平。

在BioLector XT微型生物反应器中并行光营养培养

接下来，开始长期培养，并使用四个滤光片模块进行在线监测:730 nm的散射光模块，叶绿素荧光滤光片模块(λex = 450 nm;λem = 700 nm)和两种HPTS滤光片模块进行比值pH测定(图9)。

Scattered light chlorophyll and pH
图9. 搭载光照模块的BioLector XT微型生物反应器，为期16天的培养中所监测的散射光、叶绿素和pH值

如图9所示，为期16天的培养监测中，生物量浓度持续增加，直至 CO2 供应被关闭。图中可观察到五个不同的生长阶段：首先是滞后的指数生长期（i.），之后是三个不同的线性生长期（II.至IV.），最后是CO2耗尽后进入的死亡阶段（V.）。pH和叶绿素信号的变化过程与观察到的生长阶段相关。在整个实验过程中，散射光信号的平均变异系数为5.2%，因此可在建议的设置中进行平行光营养培养。离线样本验证了在线信号的准确性。235小时后采样（此时由于短暂暴露于大气中的CO2浓度中，pH值升高），离线OD750值为40，离线pH值为7.3，这与在线测定的pH值7.2高度一致。在实验结束时，离线OD750值为60左右，表明在实验过程中培养物生长旺盛导致产生较高的生物量浓度。

结论

光照模块的加入为BioLector开创了全新的应用领域。本《应用指南》中所介绍的几种滤光片模块，可准确监测关键的光营养培养参数，如生物量浓度、叶绿素含量和pH值。

叶绿素荧光滤光片模块在低浓度生物量测定中具有良好的分辨率，与在高细胞密度下准确的散射光测量相得益彰18。此外，研究证明，基于HPTS的pH测定法是替代optode测量的理想解决方案，即便在连续照明的条件下，该方法也同样适用。

小球藻的长期培养证实，BioLector系统可用作并行、高通量培养的微升级光照生物反应器。此外，经专门设计的滤光片模块可评估培养物生长的在线信息，并揭示不同的生长阶段。

这些结果证实该平台可通过不同方式优化各种应用的光营养培养。精心设计的光照模块，支持在不同照明条件下设置较宽的光谱和辐照度范围，以便优化照明条件。多篇文献已报道这些照明特性可影响藻类生长12, 31-35。

在BioLector XT中，可通过气体流量和气体成分改变实验的气体培养条件，这是光营养培养中的一个重要参数，例如，CO2富集可获得更高的生物量浓度15,33。其他影响微藻培养的关键因素包括温度36, 37、pH15, 34、盐度38、碳源39-41、氮源33, 39和培养基成分42。BioLector XT可优化所有这些参数。

此外，建议采用分批补料培养来提高脂质产量43。由于监管限制，有关基因工程藻株潜力的研究和应用极少，但藻株经基因改造，可能具有更高的生长速率和细胞密度，更高的生产速率或滴度，更强的鲁棒性或更好的太阳能-生物量转换效率和光合生产力1,8,44,45。

所有这些因素均可通过搭载LAM的BioLector XT微型生物反应器进行研究和优化，助力研究人员加快研究进程，为实现藻类潜能所需的答案提供帮助。

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