利用BioLector进行细胞死亡的测定

碘化丙啶（PI）测定的应用方法

在本《应用指南》中，将介绍采用 BioLector 在培养过程中实时在线检测碘化丙啶（PI）。该方法信号响应快，可适用于诸如 48 孔板的高通量细胞毒性筛选。

PI 染色通常用于食品、临床样品、环境或发酵过程中细菌培养物的细胞存活率评估，也可用于真核细胞的表征。¹在微生物学研究中，细菌存活率检测作为一种关键的分析工具，广泛应用于高通量细胞毒性筛选及毒性试验的抗菌性能评估，通常采用预混合的即用型染色试剂盒基于细胞膜的完整性进行测定。碘化丙啶是一种多功能染料，常用于鉴别细胞群中的死细胞，并在多色荧光技术中用作复染剂。PI 仅能穿透细胞膜破裂的死细胞并对其染色，而不能穿透细胞膜完整的活细胞。²

PI 嵌入细胞脱氧核糖核酸（DNA）后释放红色荧光。它与 DNA 碱基结合，几乎没有序列偏好，每一个染料分子可结合 4 到 5个碱基对，与溴化乙锭相似。在水溶液中，染料的最大激发/发射波长为 493 / 636nm。3染料被结合后，最大荧光激发波长约偏移 30-40nm，移至红色波长范围。最大荧光发射波长偏移 15nm，移至蓝色波长范围，因此最大激发波长为 535nm，最大荧光发射波长为 617nm，3如图 1 所示。但是，随着死细胞和活细胞比例的增大，PI 释放的红色荧光也呈线性增加。PI 作为快速、定量分析的有效工具，可广泛适用于各种仪器：荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪或酶标仪。³

Figure 1: Fluorescence spectrum of PI bound to DNA⁴

方法

大肠杆菌培养：采用 BioLector进行大肠杆菌 Bl21（DE3）菌种培养，培养条件：温度 37° C，振摇速度 800 rpm），微孔板为 BOH2 型 FlowerPlate^® 微孔板（MTP），每孔填样体积为 800µL。培养基为缓冲液浓度为 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。

PI 浓度：将 1mM PI 染色液溶于磷酸盐缓冲液中配制 PI 原液（Sigma Aldrich, 2019）。此原液需无菌过滤并在 4° C 下储存。PI 嵌入 DNA 时，为避免对用户造成伤害，培养基中的最终 PI 浓度不应过高。在本应用指南中，培养基最终 PI 浓度应为 5 µM。为避免产生交叉荧光信号，建议使用无色培养基。

诱导细胞死亡：在此培养案例中，通过在 7 小时后将培温度提升至 50° C或加入纯甲醇（MeOH）来诱导细胞死亡。

测定死亡细胞：诱导细胞死亡后，PI 渗入细胞膜破裂的细胞与 DNA 结合，导致荧光偏移，然后通过PI 滤光片模块检测死亡细胞的荧光信号。

PI 滤光片模块：为保证在 BioLector中成功测定死亡细胞，PI 滤光片模块（滤光片 ID：432）的激发波长为 532nm，发射波长为 620nm。

结果

接下来为您介绍采用 BioLector 结合 PI 染色技术检测细胞死亡的多种应用案例。

背景荧光信号：预培养实验（见图 2）显示，与未染色培养（大肠杆菌对照组）相比，5 µM PI 染色液对微生物生长产生轻微抑制，导致散射光和溶解氧（DO）信号滞后0.5 h。此外，观察到未染色培养物中出现 PI 背景荧光交叉信号，PI 处理培养物中背景 PI 信号增强。出现这种情况，一方面是因为细胞生长过程中其他代谢物产生的荧光干扰，另一方面，溶解的 PI 也可以穿透活细胞的细胞膜造成荧光交叉。细胞分裂、细胞壁合成或应激过程受损等原因都能增大细胞膜破损的几率。因此，随着时间的推移，可以发现活细胞群 PI 信号逐渐增强。2操作过程中应时刻关注这种背景信号，避免将活细胞误检测为死细胞。为了更好地比较不同应激因素（MeOH 或热休克）的影响，所有实验均在同一培养时间（7 h）施加应激因素。

图2：预培养实验显示5µM PI对BioLector中细菌生长、DO和PI信号的影响。大肠杆菌 BL21 野生型在 Wilms-MOPS（含 10g/L 甘油）中进行分批培养。微孔板采用 FlowerPlate® 微孔板（MTP-48-BOH2），条件：V0 = 800µL，n = 800 rpm，温度 37 °C。三个生物学重复的平均值及变异系数（CV）结果如下：散射光信号：大肠杆菌对照组0.58%、大肠杆菌 5µM+PI组 0.44%；DO 信号：大肠杆菌对照组 0.50% 、大肠杆菌 5µM+PI组 0.56%；PI 信号：大肠杆菌对照组 5.99%、大肠杆菌 5µM+PI 组 3.85%

细胞毒性筛选：采用 BioLector 进行PI 染色和检测的另一个应用是细胞毒性筛选。在下一个案例中，添加 MeOH 对大肠杆菌 BL21（DE3）进行应激培养，如图 3所示。 

图 3：不同浓度的MeOH作为应急因素对大肠杆菌培养的细胞毒性筛选。大肠杆菌 BL21 野生型在 Wilms-MOPS（含 10g/L 甘油）中分批培养，在最终浓度培养液中添加 MeOH 9%v/v 或 27%v/v。微孔板使用 FlowerPlate® MTP（MTP-48-BOH2），条件：V0 = 800µL，n = 800 rpm，温度 37 °C。三个生物学重复的平均值及变异系数（CV）结果如下：散射光信号：大肠杆菌对照组 5.33%、大肠杆菌 5µM+PI 组 7.09%；DO 信号：大肠杆菌对照组 0.51% 、大肠杆菌 5µM+PI 组 1.24%；PI 信号：大肠杆菌对照组 4.27%、大肠杆菌 5µM+PI 组 4.07%。

培养 7 小时后，添加 27%v/v MeOH 时生长停滞，可通过散射光信号和 DO 信号检测得出：添加 MeOH 后 DO 信号立即增至初始值（100 %），表明细胞开始凋亡。添加 9%v/v MeOH 导致散射光信号减弱，表明生长斜率下降与 DO 信号相呼应。例如，与图 3 中以 9 %v/v 甲醇作为应激因素的细胞相比，图 2 中的对照细胞因快速生长而达到氧气限制水平。18 小时后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的细胞最终 PI 信号分别为 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。该结果对5µM PI培养基进行了空白扣除。

需要注意的是，该信号是一个相对值，与测定时间点和最终细胞数量高度相关，因为细胞接触 PI 时间和上述背景信号随时间增加而增强。因此，MeOH 处理和 PI 测定应始终在同一时间点进行。

细胞裂解的测定：采用 BioLector进行 PI 测量有助于培养实验过程中的细胞裂解的测定。在以下案例中，如图 4 所示，培养 7 小时后，将温度从 37° C 提升至 50° C 以诱导细胞裂解。散射光信号表明，经 5 µM PI 处理的大肠杆菌未进一步生长，热处理 1 小时后对照组也未进一步生长。未经热处理大肠杆菌（+ 5µM PI）的生长曲线显示，细菌在 11 小时前呈指数增长，之后进入稳定期。热处理后大肠杆菌停止生长，2 小时后，细胞开始裂解，因此 PI 信号呈线性增强，并约在培养 14 小时后达到饱和。之所以延迟 2 小时，是因为热量在液体中分布并作用于细胞需要时间。未经热处理组的 PI 曲线在指数生长期可观察到背景荧光信号。

图 4：采用BioLector 通过 PI 染色测定细胞裂解。大肠杆菌 BL21 野生型在 Wilms-MOPS（含10g/L 甘油）中进行分批培养。微孔板使用 FlowerPlate® MTP（MTP-48-BOH2），条件：V0= 800µL，n = 800 rpm，温度为 37°C。三个生物学重复的平均值及变异系数（CV）结果如下：散射光信号：大肠杆菌对照组 1.86%、大肠杆菌 5µM+PI 组 1.49%、大肠杆菌 5µM+PI（未经热处理）组 0.44%；PI 信号：大肠杆菌对照组 6.75%、大肠杆菌 5µM+PI 组 3.96%、大肠杆菌 5µM+PI（未经热处理）组 3.85%。

应激细胞测定。在正在进行的培养实验中，散射光和 PI 信号的结合有助于识别应激细胞。在以下案例中，大肠杆菌 BL21 分别在两种不同 MOPS 缓冲液浓度的 Wilms-MOPS 培养基中培养。图 5表示散射光、DO 信号、pH 值和 PI 信号随培养时间变化的实验结果。

图 5: 采用 BioLector通过 PI 测量应激细胞。大肠杆菌 BL21 野生型在 MOPS 缓冲液浓度为 50mM 或 200mM 的 Wilms-MOPS 培养基（含有10g/L甘油）中分批培养。微孔板使用 FlowerPlate® MTP（MTP-48-BOH2），条件：V0= 800µL，n = 800 rpm，温度为 37°C。三个生物学重复的平均值及变异系数（CV）结果如下：散射光：大肠杆菌 5µM+PI（50mM 缓冲液）组 0.57%、大肠杆菌 5µM+PI（200mM 缓冲液）组 0.45%；pH：大肠杆菌 5µM+PI（50mM 缓冲液）组 0.17%、大肠杆菌 5µM+PI（200mM 缓冲液）组0.26% ；DO：大肠杆菌 5µM+PI（50mM 缓冲液）组1.08%、大肠杆菌 5µM+PI（200mM 缓冲液）组 2.14%；PI 信号：大肠杆菌 5µM+PI（50mM 缓冲液）组 2.93%、大肠杆菌 5µM+PI（200mM 缓冲液）组 3.66%。 

蓝色实线表示在缓冲液浓度为 200mM 的 Wilms-MOPS 培养基中的培养结果，虚线表示在缓冲液浓度为 50mM 的培养基中的培养结果。如果只关注生物量信号，可以假设生物量在缓冲液为 50mM的培养基中比在缓冲液为 200mM 的培养基中增量更大。但是，PI 信号和 DO 信号的结果相反。可知，这与生物量无关，而是因为细胞破裂的颗粒释放到培养基中。缓冲液浓度较低的培养基其 pH 值迅速降至 5.5 以下，因此在 5-9 小时的指数生长期间 pH 值低于最优范围。结果导致生长停止，DO信号在 9 小时后 pH 降至 5.5 以下时迅速增强可以证实这一点。因此，DO 信号跃至初始值 100%。相比之下，缓冲液浓度为 200mM 的培养基 pH 值更稳定，在指数生长期，9.5 小时后 pH 值从 7.3 降到6.5。DO 信号在 10 小时时出现双峰转换。此时，大肠杆菌正在消耗产生的醋酸盐，导致 DO 直至培养结束都增长缓慢。此外，pH 值增至 6.7。总而言之，缓冲液浓度为 200mM 的培养基可确保整个分批培养过程获得最优 pH 条件，因而其细菌培养条件优于缓冲液浓度较低的培养基。缓冲液浓度较低的培养基中 PI 信号强度远超缓冲液浓度为 200mM 的培养基。与缓冲液浓度较高的培养基相比，缓冲液浓度较低的培养基在培养 11 小时后，其PI 信号因低 pH 值应激导致细胞破裂而呈指数增强。培养过程结束时，该值比缓冲液浓度为 200mM 的培养基背景信号大 2.5 倍。通过结合散射光信号和 PI 信号，可知，在缓冲液浓度为 50mM 的培养基中细菌生长并没有更好。然而，我们可以在培养结束时追溯到细胞裂解的过程。这种裂解导致培养液中片段的增加，从而导致散射光信号的增加，同时由于可用的游离DNA, PI信号也增加。

结论

本《应用指南》介绍了使用 BioLector结合 PI 染色法鉴别培养过程中死细胞或应激细胞的广泛应用实例。我们正在积极开发更多的应用可能性，例如用死细胞的细胞数来校准 PI 原始信号。以及使用附加滤光片模块测量活细胞比例，从而可以测量死/活细胞相对于总细胞数的比值，实现细胞活率的检测。

参考文献

[1] Krämer, C., et al.: Time-resolved, singlecell analysis of induced and programmed cell death via non-invasive propidium iodide and counterstain perfusion. Scientific Reports, 2016.

[2] Stiefel, P., et al.: Q.: Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BioMed Central, 2015. [3] Propidium Iodide Nucleic Acid Stain, https://assets.thermofisher.com/TFSAssets/LSG/manuals/mp01304.pdf (05.09.2018), Molecular Probes™, 2006.

[3] https://www.thermofisher.com/order/ catalog/product/V13241?SID=srch-srpV13241, ThermoFischer Scientific, 2019.