利用RoboLector提高谷氨酸棒状杆菌蛋白质产量的培养基优化研究

前言

生物技术产业对培养基和工艺优化有着严格的要求。而优化工艺过程以获得尽可能高的产量通常非常耗时。我们应在尽可能减少工作量的同时获取更多信息。BioLector是一种微型生物反应器系统，该系统可在线监测生物量、pH值、溶氧（DO）和各种荧光分子或蛋白质的荧光强度，同时还能结合微流控芯片技术控制 pH 和补料，并可放大工艺。结合 RoboLector®，BioLector成为通过实验设计（DoE）进行培养基制备和执行自动化高通量培养过程的有力工具。该系统基于标准微孔板（MTP），在发酵过程中进行非侵入式的光学测量。该技术可通过微流控通道进行工艺控制，实现各培养孔独立的 pH 控制和补料分批培养。

在本《应用指南》所描述的研究项目¹中，我们采用 RoboLector和 BioLector对谷氨酸棒状杆菌的基本培养基（CGXII 培养基）进行优化。DoE培养基优化侧重于提高谷氨酸棒状杆菌的角质酶活性。采用 BioLector对该微生物进行分批培养和补料分批培养，研究培养基成分和补料速率对与生长相关的角质酶蛋白表达的影响。并由此，我们进一步证明了可在微升级条件下成功进行微生物高密度培养。

方法

培养基成分：谷氨酸棒状杆菌初始标准基本培养基（CGXII 标准），由 42g/L 3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、22g/L 葡萄糖、20g/L硫酸铵、5g/L 尿素、1g/L 磷酸盐缓冲液、13.25mg/L 氯化钙、0.25mg/L 七水硫酸镁、10mg/L 七水硫酸亚铁、10mg/L 一水硫酸锰、1mg/L 七水硫酸锌、0.2mg/L硫酸铜、0.02mg/L六水合氯化镍、0.2mg/L生物素、30mg/L原儿茶酸(PCA)、50mg/L卡那霉素和59.6mg/L异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）组成。

BioLector的 CGXII 培养基（CGXII-BLP）含有 5.5g/L 3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、6mg PCA，不含硫酸铵。其他成分的浓度与 CGXII 标准培养基相同。基于 CGXII-BLP 培养基进行培养基优化。

敏感性分析： 敏感性分析是一个重要的工具，可以表征出某些培养基的优化潜力，并确定培养基成分对微生物的生长和蛋白质生产消极或积极的影响。该系列实验被认为是 DoE 中实际优化操作的准备步骤。本方法每种培养基成分的影响是单独考虑的。为此，我们将待优化培养基中的各成分浓度减半，然后在下一个实验中加倍添加。每次仅改变培养基中的一种成分，以便随后使用 BioLector观察分批培养过程中的生长行为。该系列实验结束时，我们发现对角质酶活性产生最有利影响的培养基成分为：硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。

使用DoE-Builder优化培养基： 以上述敏感性分析中对角质酶分泌量具最有利作用的三种培养基成分为对象，研究其不同浓度组合的影响：使用 DoE-Builder 改变硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰的浓度。硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰的浓度范围分别为 0-500mg/L、0-20mg/L 和 0-20mg/L。其他成分及其浓度保持不变。以另一组浓度不变的培养基（CGXII-BLP）作为对照。最后，利用模型对角质酶活性进行了15次浓度组合试验。本方法共执行了两个优化步骤。

使用 RoboLector® 制备培养基：采用自动化工作站制备培养基。该方法可提高培养基制备通量。手动或自动方法对微生物生长没有显著影响差异，因而无需进行方法验证²。由于补料分批培养试验中优化培养基的成分保持不变，所以自动化方法仅专用于分批培养试验中的培养基制备。

培养菌株：在本项目中，谷氨酸棒状杆菌（ATCC 13032）pEKEx2-NprE 角质酶菌株在 CG XII 培养基中培养。该菌株由德国 Forschungszentrum Jülich 公司生物与地球科学研究所（IBG-1）提供。角质酶来源于腐皮镰胞菌。从枯草芽孢杆菌获得的信号肽通过Sec-Pathway 分泌。

培养条件： 在第一次预培养中，100µL 谷氨酸棒状杆菌 pEKEx2-NprE 角质酶菌株在装有10mL BHI（Brain Heart Infusion）+ 50mg/L 卡那霉素的250mL 摇瓶中过夜培养，温度为 30°C，振摇速度为 250rpm、振荡直径 5cm。第二次预培养在装有 10mLCGXII 标准培养基的 250mL 摇瓶中过夜进行，温度为 30°C，振摇速度为 250rpm、振荡直径 5cm。

在 BioLector中使用 48 孔 梅花板 （MTP-48- BOH1）分批培养谷氨酸棒状杆菌，CGXII-optimized培养基，温度为 30°C，振摇速度为 1200rpm，初始 OD600 为0.5，每孔初始体积为 800µL。MTP使用可减少蒸发的透气性密封膜（F-GPR）密封。

在 BioLector中使用32 孔微流控梅花板（MTP-MF32-BOH1）补料分批培养谷氨酸棒状杆菌，CGXII-optimized培养基，温度为 30°C，振摇速度为 1200rpm，初始 OD600 为 0.5，每孔初始体积为 800µL（微流控 梅花板的 C-F 行）。MTP 使用可减少蒸发的透气性密封膜（F-GPRSMF32）密封。pH 值调控为7。在微流控 梅花板A 行的每个储存孔中添加 1800µL 的 3M 磷酸。以线性方式补充葡萄糖：1 g/(L∙h) + 0.1 µL/h、2 g/(L∙h) + 0.1 µL/h、3 g/(L∙h) + 0.1 µL/h、4 g/(L∙h) + 0.1 µL/h。补料量可由式（1）表示，这里以 3 g/(L∙h) + 0.1 µL/h为例：

f(t) = 5,45 µL/h + 0,1 µL/h (1)

将线性补料策略的触发设置为大于 14h，恰好为分批培养阶段结束。将补料溶液（含 440g/L 葡萄糖和 100g/L 尿素）添加至微流控梅花板 B 行中，每个储存孔 1800µL。

生物量校准：为测定细胞干重（CDW），制备了 OD600 = 0 和 OD600 = 37.2 之间的一系列谷氨酸棒状杆菌稀释液，并使用分光光度计重复测量三次。

在各 OD 稀释步骤中取 1mL，分别倒入预先干燥（80°C 下 24 小时）并称重的 1.5mL 反应管中，以 4000rpm 转速离心 5 分钟。弃去上清液，细胞沉淀物重悬于 1mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。重复离心分离步骤，再次弃去上清液。在 80°C 下干燥 24 小时后，通过重量差计算出细胞干重（CDW）。采用相同的 OD600 稀释系列进行背向散射光强（BS [a.u.]）测定（生物量增益 3 和 5），在微流控梅花板（MTP-MF32-B）中校准，进样体积为 800µL，转速为 1200rpm，温度为 30°C。背向散射光值至少测量 30 分钟。由背向散射光校准得出 CDW [g∙L -1 ] 和 OD [-]的线性回归方程（2）和（3），R2 > 0.99。

CDW = 0.5009 g∙L ^-1 ∙a.u.^-1 ∙BS – 1.1956 g∙L ^-1 (2)

OD = 2.0044 a.u.^-1 ∙BS – 3.4291 (3)

图 1 表示用于计算 CDW 的生物量（增益 3）校准曲线示例。

图 1  BioLector中细胞干重（CDW）的校准曲线

细胞收获：在指数生长末期或平台期早期角质酶活性最高时收集细胞。将 BioLector^® 连接至 RoboLector^® 以便取样。利用 RoboLector^®，可在每次培养中平台期的同一时间点收集样品。然后离心处理样品，低温存储于 酶标仪中供后续使用。

酶活性测定：采用脂肪酶活性测定法³ 测定培养物上清液角质酶的解脂酶活性。该测试基于对硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）水解为对硝基苯酚（pNP）。反应缓冲液呈碱性，导致 pNP 脱质子生成 4- 硝基苯酚盐。通过酶标仪测定 410nm 波长处的吸光度。

结果

PCA 原儿茶酸浓度的影响： 在 BioLector内进行培养的过程中，需将 PCA 浓度减至 6mg/L，以避免pH 传感器受到干扰。在之前的研究中，为获得更好的实验结果，我们开发出一种更适用于 BioLector的培养基（CGXII-BLP）⁴。铵盐成分已被去除。由于 PCA 成分对微生物生长和重现至关重要，因此无法将其从培养基中彻底去除⁴。但是，PCA 成分对梅花板中pH 传感器的不利影响可能会导致 BioLector 在线测量的 pH 值与离线测量的 pH 值有所不同。因此，后续的实验必须使用含有较少 PCA 的优化 CGXII-BLP 培养基，确保尽量减小在线和离线 pH 值之间的差异。

敏感性分析：敏感性分析：使用 BioLector的生物量校准功能将生物量的散射光信号转变成光密度，以评估谷氨酸棒状杆菌生长是否有改善以及角质酶活性是否增强。将 CGXII-BLP 培养基中的 10 种不同成分分成 38 个不同组进行分析评估，每组 6 个生物学重复。此项敏感性分析的第一部分（见图 2 和图 3），对 10 种与生长及角质酶活性相关的不同培养基成分进行比较。此项敏感性分析的第二部分（见图 4 和图 5），排除硫酸锌和硫酸铜影响后分析七种不同的培养基成分。图 2 显示浓度减半后的 OD 和角质酶活性。所有情况下的光密度值均低于对照值。此外，结果表明，每份样品中相应成分浓度减半，谷氨酸棒状杆菌出现不同的反应。比如，硫酸亚铁等微量元素的减少导致蛋白分泌量下降。

图 2  含有硫酸铜和硫酸锌的培养基成分浓度减半情况下的敏感性分析。

In 相比之下，硫酸亚铁浓度增加一倍（见图 3），角质酶活性增强。这里活性比浓度减少时高 14.5 %。含有金属离子的微量元素影响细胞壁结构，因此对分泌作用有积极影响⁵。另外，硫酸铜和硫酸锌浓度翻倍后，对谷氨酸棒状杆菌生长和角质酶活性产生不利影响。

图 3   含有硫酸铜和硫酸锌的培养基成分浓度翻倍情况下的敏感性分析。

第二个敏感性分析考虑到硫酸铜和硫酸锌对谷氨酸棒状杆菌生长和角质酶活性产生不利的影响，故使用了不含这两种成分会的优化培养基。其余培养基成分的浓度先减小（图 4）后增大（图 5）。尿素浓度升高时促进生长，但是尿素浓度降低时角质酶活性增高 13%。一般而言，除去硫酸铜和硫酸锌成分可增强角质酶活性。研究表明，在不添加硫酸铜和硫酸锌的情况下，与两者均添加的对照组相比，硫酸锰、硫酸亚铁和硫酸镁的浓度无论减半还是翻倍，均对谷氨酸棒状杆菌产生有利影响。

图 4 未添加硫酸铜和硫酸锌的培养基，其余成分浓度减半情况下的敏感性分析。

图 5 未添加硫酸铜和硫酸锌的培养基，其余成分浓度翻倍情况下的敏感性分析。

培养基成分中，硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰对谷氨酸棒状杆菌的性能影响最大。选择这三种培养基成分不仅是基于是 CGXII-BLP 配方培养基中目标大小增加的结果，还因为金属离子不但对目标蛋白的净电荷（单纯这一点也对分泌性能产生影响）有影响，还会影响分泌系统的蛋白质⁸。与添加和未添加硫酸铜和硫酸锌的试验结果相关的百分比变化，通过表 1 所列各培养基成分的浓度翻倍进行测定。在未添加硫酸铜和硫酸锌的情况下，硫酸镁浓度增加一倍时，培养基 OD 增大 0.19 %，而硫酸锰浓度增大一倍时，培养基 OD 增大 4.48%。硫酸亚铁浓度翻倍时，光密度比添加硫酸铜和硫酸锌的培养基低 5.71 %。

表 1 未添加硫酸锌和硫酸铜的培养基，其余成分浓度翻倍情况下目标值的相对变化。 

使用 DOE builder优化培养基：基于培养基优化的敏感性分析结果，利用 DoE-Builder Modde^®（Umetrics）分两个优化步骤进一步研究培养基成分硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰，以规划实验和验证浓度。考虑到硫酸锌和硫酸铜均在角质酶分泌方面对谷氨酸棒状杆菌产生不利影响，使用未添加硫酸锌和硫酸铜的CGXII-BLP 培养基进行培养基优化。故使用不含这两种成分的 CGXII-BLP 培养基进行培养基优化，第一个优化步骤设计 15组实验。表 2 列出第一个优化步骤采用的实验组合。硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰的浓度范围分别为 0-500mg/L、0-20mg/L 和 0-20mg/L。CGXII-BLP 培养基其余成分的浓度保持不变。每个优化步骤均使用未添加硫酸锌和硫酸铜的CGXII-BLP 培养基进行一组对照试验。因此，采用 BioLector 在 梅花板 中进行 15 组不同的实验，每组实验进行4 个生物学重复。

表 2  第一个优化步骤 CGXII-BLP 培养基成分浓度组合

在第一个优化步骤中，对 15 组实验进行比较，每个实验有 4 个生物学重复。图 6 为每个实验测定的 OD 和角质酶活性示意图。

图 6 在第一个优化步骤中测定的光密度和角质酶活性

第一个优化步骤的光密度结果表明，谷氨酸棒状杆菌的生长特别依赖于硫酸镁（见图 6：N1、N3、N5、N7、N9）。例如，如果培养基的成分中缺少硫酸镁，则生长与对照实验相比减少 80%。因此，硫酸镁是角质酶活性增强的决定因素。实验 N4 和N13 显示，当培养基中缺少硫酸锰时，对棒状杆菌的生长和角质酶分泌无相关影响。这一现象在实验 N8 和 N10 中表现尤为明显，导致了最高的角质酶浓度。在实验 N10 中，硫酸亚铁和硫酸锰为初始浓度，而在实验 N8 中，硫酸锰浓度增加一倍。N8 和 N10 的角质酶活性分别为8.02 U/L 和 7.96 U/L。与对照实验相比，N8 光密度增大 9.33%，角质酶活性增强 39.23%。因此，硫酸镁是角质酶产量增多的决定因素。接下来，将测得的角质酶活性输入软件，为第二个优化步骤提供输入数据。采用DoE 中的多元线性回归（MLR）法。图 7、图 8 和图 9 中硫酸锰浓度分别为 0mg/L、10mg/L 和 20mg/L 这三种可变参数与角质酶活性的 4D 关系图。图中红色表示最高预期活性的范围。在第二个优化步骤，优化工具提供以下提高角质酶活性的因素设置和理论目标。

图 7 硫酸锰浓度为 0mg/L 时与不同浓度硫酸亚铁和硫酸镁的 4D 图

图 8 硫酸锰浓度为 10mg/L 时与不同浓度硫酸亚铁和硫酸镁的 4D 图

图 9  硫酸锰浓度为 20mg/L 时与不同浓度的硫酸亚铁和硫酸镁的 4D 图

基于第一个优化步骤的结果，计算出 24 个理论上优化的实验，并使用 BioLector在梅花板中进行分批培养。第二个优化步骤的组合见表 3。有关光密度和角质酶活性值的结果见图 10。在这里，N1 和 N13 为平均值并标为“对照”。

表 3 第二个优化步骤 CGXII-BLP 培养基成分浓度组合

图 10 在第二个优化步骤中测定的光密度和角质酶活性

所有实验的光密度差异微乎其微，实验 N2 除外，因为除了该实验，其余实验的培养基成分完整，微生物生长良好。此外，在第二个优化步骤中，不同实验的浓度差异极小。相较之下，分泌蛋白产量及角质酶活性显示出批次间的显著差异，如图 10 所示。这里，与对照实验和第一个优化步骤最好结果（见图 6 的 N8）相比，N12 的培养基组成从角质酶活性角度来看有明显改进。与对照实验相比，N12 光密度增大 9.46%，角质酶活性增强 47.82%；与第一个优化步骤的N8 相比，光密度增大 4.57%，角质酶活性增强 1.75%。本试验系列开发的最终优化培养基（CGXII 优化）含有 400mg/L 硫酸镁、25mg/L硫酸亚铁和 20mg/L 硫酸锰。与 CGXII-BLP 培养基相比，这相当于硫酸镁浓度增加 60%，硫酸亚铁浓度增加 150%，硫酸锰浓度增加 100%。金属离子浓度升高说明这些成分与硫酸镁组合对蛋白质分泌的重要性。其中一个原因是金属离子通过细菌细胞壁影响蛋白质分泌。细菌细胞壁负电荷密度高，能够结合阳离子。这一特性使分泌蛋白可以折叠^6,7。

不同补料速率比较：使用 DoE 成功开发出优化的 CGXII 培养基，从而可以在 BioLector®中以不同补料速率进行实验，找到提高蛋白产量的理想补料分批培养条件。底物溶液的补充速度是一个重要的参数，直接影响微生物的生物量增长和角质酶的形成。为此，我们研究了两种补料工艺。第一种，在优化的 CGXII 培养基中分批培养谷氨酸棒状杆菌，最终底物浓度为 5g / L 葡萄糖。随后，开始以线性方式补充葡萄糖。在整个培养过程中，将浓度为 35% 的氧气通入培养物的顶部空间。此外，使用 3M磷酸将 pH 调至 7.0。总共采用四种不同补料速率对线性补料策略进行调整，以检查和比较底物补给对角质酶分泌量的影响。优化 CGXII 培养基培养工艺示例见图 11。

图 11  在 BioLector中使用优化的 CGXII 培养基以线性补料速率 5.45µL/h + 0.1µL/h 对谷氨酸棒状杆菌进行补料分批培养

图中显示了线性补料速率为 3g/L∙h + 0.1µL/h 时培养物的生长曲线和溶氧值。培养 14 小时后开始补料，以启动补料分批培养。在这个时间点，未观察到氧气限制。补料分批培养阶段结束时，光密度为 9.88，此后开始线性补料。随后，生物量信号持续增强，光密度增至 17.13，持续约 21h。21h 后，细胞开始进入指数生长阶段，与此同时，溶解氧开始减少。28.5h 后，出现氧气限制，31h 后生物量增长速度减缓可以反映这一点。37.5h 后，光密度增至 OD=110，并在 45h 后持平。培养后期的这种行为表明，谷氨酸棒状杆菌的生长由于其所需的微量元素缺乏或氧气限制而受到抑制。此外，49.5h 后 DO 信号明显增强，表明此时培养菌停止生长。图 12 显示在 BioLector 中不同线性补料速率下，谷氨酸棒状杆菌的角质酶活性。

图 12 不同线性补料速率（以 0.1µL/h 增加）条件下，谷氨酸棒状杆菌角质酶的活性比较

这里比较四种不同的补料速率：1g/L∙h + 0.1µL/h、2g/L∙h + 0.1µL/h、3g/L∙h + 0.1µL/h 以及 4g/L∙h + 0.1µL/h。在 BioLector相同的环境条件下，使用优化 的CGXII 培养基进行各实验，每种补料速率设定 8 个生物学重复。谷氨酸棒状杆菌线性补料结果表明，补料速率为2g/L∙h + 0.1µL/h 时获得角质酶活性最高：45.64U/L。该结果分别比补料速率为 1g/L∙h、3g/L∙h 和 4g/L∙h 时获得的角质酶活性分别高 11.70%、10.80% 和 21.93%。各补料速率获得的角质酶活性及相应产率见表 4。从该表可知，补料速率为 2g/L∙h + 0.1µL/h 时产率最高，为 0.88U/L∙h。

表 4  BioLector中不同线性补料速率下的角质酶活性和产率

图 13不同补料速率下的光密度。

图 13 不同线性补料速率（以 0.1µL/h 增加）条件下谷氨酸棒状杆菌光密度的比较

补料速率为 1g/L∙h + 0.1µL/h 时光密度最小：56.88。补料速率分别为 2g/L∙h + 0.1µL/h、3g/L∙h + 0.1µL 以及 4g/L∙h + 0.1µL/h 时光密度分别为106.95、115.40 和 110.54。总之，在整个培养过程中，补料速率仅为 1g/L∙h + 0.1µL/h 是不够的，因为光密度仅达到 56.88，比补料速率为 2g/L∙h时获得的 OD 低 46.82%。而且，40.30U/L 的角质酶活性比补料速率 2g/L∙h 时获得的活性低 11.70%。另外，补料速率为 3g/L∙h 和 4g/L∙h 时的结果表明：线性补料速率越高，受到更多氧气抑制的谷氨酸棒状杆菌角质酶产量下降越明显。

结论

本《应用指南》展示了采用 RoboLector进行培养基优化以提高谷氨酸棒状杆菌蛋白产量的示例。此外，采用经优化的培养基在 BioLector 中用于补料分批培养，旨在寻找提高谷氨酸棒状杆菌细胞密度和角质酶活性理想的补料条件。本研究表明 RoboLector非常适用于 DoE 环境下的培养基优化和补料分批培养的验证实验。

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