简化外泌体分离
差速超速离心法被称作外泌体分离的黄金标准方法，1 因为该方法已被广泛采用同时可以产生高纯度的外泌体。自动化多步骤分离和表征的工作流程可以提高速度和准确性，同时最大限度地减少动手时间和操作过程中的可变性。尽管看似简单的前提（以多种速度进行多次旋转）工作流中有几个步骤，但使用手动方法进行标准化可能比较棘手。为了提高分离的外泌体及其衍生的任何数据的价值，液体处理自动化可确保可重复性、可追溯性和准确性。了解自动化如何实现更深入的分析、提高下游的灵活性，以及更准确地识别跨时间点和条件下的外泌体“货物”的微小变化。
生长的细胞进入对数生长期
注意：如果您的起始材料是来自液体活检的生物流体，您可以跳过此提示。
在大多数实验室中，生长的细胞进入对数生长期是细胞生长的第二种惯性倾向。所需要的只是一点额外的时间和一个血球计数器，所以不是细胞培育进入对数生长期的阶段，而是细胞在进入对数生长期前的植培需要额外的关注。通常，尽管科学家尽了最大努力，通过血球计数器获得的细胞计数可能由多个变量曲解，包括聚合、不均匀的混合物和不正确的计算。为防止细胞密度错误从一开始就破坏外泌体分离，可靠的细胞计数器和用于细胞接种的液体处理自动化可以提供有时在日常动手操作中缺失的准确性和标准化实验室工作。
接种过少或过多细胞需要通过分光光度计进行警惕监测，以免错过细胞的对数生长期，并且在细胞计数不准确的情况下传代，可能无法同时进行外泌体采集。在可预测的密度接种的细胞应在可预测的时间达到对数生长阶段，使您的试验按计划正常进行。在处理贴壁的哺乳动物细胞时，通常会同时培养几种不同的细胞，实现在不破坏实验细胞的情况下通过分光光度计评估细胞生长阶段。除了标准化细胞接种方法显而易见的好处外，了解细胞的典型生长属性有助于提醒您细胞或培养条件的问题。如果你的细胞通常在18小时内达到汇合，但是实际上延迟或提前完成了汇合，也许是时候表征新的细胞等分量，或者它可能预示着介质成分或孵育条件发生了变化。
为什么在采集外泌体时，对数阶段生长很重要？
由于外泌体是终极目标，细胞生长的条件（以及外泌体释放的条件）可以直接影响外泌体的质量及其“货物”的价值。例如，在压力条件下生长的细胞（类似于在过度拥挤、固定阶段培养基中的细胞群）体现出外泌体“货物”的变化，以反映其更恶劣的生长环境。如果您的实验目标是在正常条件下重演外泌体产物，确保您的外泌体在恰当的时间采集很关键。
了解您的转子，以便准确超速离心
当谈及共享超速离心机时，人们可能会感到一种不安的胁迫感。这是一个价格昂贵的设备，相比仅仅损失了得之不易的样本，我们都听说过人们使用错误的试管或错误的RPM/rcf/g转换而导致仪器故障的糟糕案例。不仅在制备样品时，同时也在为试验任务选择合适的转子时，超速离心都需要高水平的精确度。基于离心机的角速度和转子半径的计算，选择具有低 k 因子的转子，可确保样品最高效的差速分离。1例如，与定角转子相比，水平转子的最小半径和最大半径之间存在更大的差值，这意味着相同的样品在定角转子中比在水平转子中能够更快地被清除，并根据它们的等密度点在密度梯度中实现更加准确的生物粒子分离。 请记住，k 因子在特定离心机中使用时是指特定的转子，并且必须在每个转子/离心机组合时被重新计算。速度是第二个需要记住的变量，并且它会根据使用的转子和所选的设置而变化; 确保您的样品在正确的速度和正确的时长旋转对于成功通过差速离心进行外泌体分离至关重要。为了尽量减少错误的转子导致样品造粒，请放心使用贝克曼转子选择工具来选择您需要的转子。
准备密度梯度
密度梯度对于分离的外泌体的纯度至关重要，因为它们利用外泌体和其他类似大小的粒子（如病毒和小型凋亡体）之间的密度差异，可靠地将它们彼此分离。传统的密度梯度由不同浓度的蔗糖溶液构建而成，但较新的实验方案要求使用碘克沙醇梯度来改善外泌体大小的分离和外泌体的等渗保存。其他用于外泌体分离的方法也经常被倡导，但均未证实优于通过密度梯度进行超速离心达到外泌体分离纯度和外泌体“货物”多样性的方法。因为密度梯度是保证超速离心制备外泌体的纯度的关键，确保准确制备稳定一致的溶液以及精确分层梯度对整个试验都至关重要。出于这些目的，自动化液体处理是绝佳的选择。自动化液体处理机能够仔细地将碘醇/蔗糖溶液分层，形成不连续的密度梯度。
确定外泌体大小和浓度
一旦分离，外泌体可以直接分析其“货物”（蛋白质，脂质，核酸等），或者他们可能被进一步表征，以提供它们起源细胞的线索。可以自动执行的一个常见表征步骤是外泌体大小分析，它依赖于纳米粒子跟踪来识别稀释剂内的外泌体大小分布和浓度。纳米粒子跟踪分析 （NTA） 器件可轻松集成到完整的外泌体分离和表征中，从而能够准确、可重复地确定外泌体大小和浓度。
促进下游分析
在大多数情况下，外泌体分离的最终目标不仅仅是收集外泌体，而是研究其“货物”，作为一种理解这种新认识的细胞间通信形式的手段。科学家已经成功地从外泌体中分离出 DNA、4RNA、5，6 和蛋白质 7，8，并使用它们来分析小型信使的关键成分和影响。其中一些分析，如 RNA-seq，需要仔细和可重复的配置反应体系，这可以通过液体处理自动化来完成，而其他分析，如 ELISA，需要板准备，孵化和板读取能力，以上所有都可编程为无缝工作流，实现智能、灵活自动化。
用差速超速离心外泌体分离是高纯度提取的有效可靠的方法。多步骤工作流要求极高的精度和可重复性，使其成为自动化的天然选择。要了解有关自动化外泌体分离和表征功能的更多详细信息，请从阅读本应用程序说明开始。
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