用于检测方法的分离与表征
由于微囊、脂蛋白颗粒、微生物、微体、蛋白质聚合体以及 DNA 和其他在提纯过程中的坏死产物等污染物的存留，分离外泌体在技术上具有挑战性。1 这导致我们很难准确表征外泌体并将其用于试验和其他下游应用。1 外泌体表征不仅对了解它们的属性和功能很重要，同时还对识别独特的标记蛋白十分关键。这些标记蛋白可以帮助建立一种评估样品是否存在外泌体的方法。分离方法的标准化有可能提高外泌体的数量和质量，提高使用外泌体制剂获得的结果的可重复性。虽然外泌体因其在疾病诊断和治疗中的潜在作用而备受关注，但在外泌体技术在临床环境中使用之前，确定外泌体样本的纯度是必不可少的一步，因为外泌体样本中含有杂质可能有不良的副作用。在临床诊断中，样品中的污染物可能造成假阴性或假阳性结果，而导致患者误诊。2
外泌体分离方法
外泌体由大多数细胞类型分泌，因此，可以从细胞培养以及体液中分离出来，包括血浆、尿液、唾液、血清和脑脊液。3 每种样品类型都有专门的外泌体分离协议，根据广泛的参数列入离心速度，过滤和密度梯度的使用，以及其他技术。其中最广泛实用的外泌体分离和纯化的方法是差速超速离心，在此过程中一系列旋转有助于逐步减少污染物，如死细胞、细胞碎片、血小板、蛋白质和核酸复合物及聚集体，以及分离物中的其他污染物，1 然而，非外泌体污染物，如脂蛋白、病毒和细菌、微体、DNA和坏死产物（如凋亡体）和蛋白质聚集物可能仍然存在。
而其他外泌体分离技术，通常与差速离心结合使用，包括：碘克沙醇密度梯度、沉淀、超滤、免疫亲和力分离、尺寸排阻色谱和微流体技术.5 每种方法都有优点和缺点，因此应注意选择最适合下游应用的方法。此外，一些分离和纯化方法可能产生最高产量的蛋白质，但使囊泡在某些应用中无法存活。例如尺寸排除色谱技术已被证实能够在相对低污染、低成本和短加工时间的条件下产生高纯度的样本，但最终样品可能过分稀释，一次或许只能处理一个样品，而且该过程可能耗费大量人力。5
样品中的非外泌体含量对分析外泌体特性以及它们在试验和其他方法中的使用构成重大挑战。一些污染物在囊泡制备中难以清除，包括脂蛋白颗粒、微生物、微体、蛋白质聚集物以及 DNA 和其他坏死产物。1 根据外泌体纯化后特定的下游应用，可采取进一步措施从纯化的外泌体样品中去除污染物。例如，实验证明，用碘克沙醇密度梯度产生的外泌体制剂可达到高纯度，外泌体标志物 CD63 的富集和蛋白质杂质的消失（如细胞外Argonaute-2）就证明了这一点。6 估计污染的蛋白质数量的常用方法是比较纳米囊泡数目的比例（通过体囊可视化技术如 NanoSight 平台获得）与蛋白质浓度（通过色度蛋白测定法，如 BCA 测定法）的比率。污染的蛋白质的存在改变了这个比率，并因此可以提供一个该外泌体样本纯度的估测。据报道，拥有比率超过 3 x 1010 个颗粒/ µg 蛋白质的样本被认为具有高纯度，而该比率在 2 × 109 到 2 × 1010 个颗粒/ µg 蛋白质的样本被认为是低纯度的。7 当在制定一个分离方案时，建议对样品进行评估和优化，不仅要考虑外泌体，还要考虑有没有污染因素。
外泌体表征
几种常见的策略被用于确定外泌体的数量和纯度，并进一步用于在纯化后进一步表征囊泡。5 动态光散射 （DLS） 分析与分析性超速离心技术一起使用时，会根据光散射特征选择性地丰富特定尺寸范围内的外泌体。质谱法可用于识别体外泌体中的蛋白质货物，并确定样品中是否含有蛋白质聚合物或其他污染物。5 电子显微镜可用于可视化囊泡形态和大小，同时当与免疫标记结合使用时，可以可视化外泌体的特定特征，如表面蛋白。传统的免疫蛋白印迹可以检测样品中某些蛋白质的存在，但不能确定外泌体数量。用于评估外泌体制剂的质量和数量的其他技术包括：原子力显微镜、光学单粒子跟踪、流式细胞测定和电阻脉冲传感。1
大量的外泌体标记已被识别并运用于证实制剂中存在外泌体。常见的蛋白质标记物包括 Alix、TSG101、CD9 和 CD63，其他被认为在外泌体中富集的蛋白质包括 DIP2B 和四膜蛋白超家族的成员。2 然而，并非所有的外泌体都含有这些蛋白质。在线数据库 ExoCarta (http://www.exocarta.org/) 是帮助研究人员识别和表征外泌体货物的工具。该数据库包含蛋白质、RNA 序列和脂质，这些蛋白质和已在特定的外泌体制剂中识别出来的脂质。最终，例如从肿瘤衍生的外泌体中识别蛋白质标记物，可用于开发肿瘤患者的临床诊断测试。外泌体分离和鉴定的标准化是得到可靠和可重复的测定结果以及其他下游应用的必要步骤，包括临床和制剂的应用外泌体收集的无数来源以及各种分离技术，为协议标准化和获得一致和可重复的结果带来了许多挑战。1
参考文献：
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7. Webber J, Clayton A. How pure are your vesicles? J Extracell Vesicles 2013;2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.
8. Mathivanan S, Simpson RJ. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics 2009;9:4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351.
