高复杂性流式细胞术面临的多重挑战
Mª Joséfa Marco
Dr. Peset医院血液科
请您简单介绍一下高复杂性流式细胞术。相对于低复杂性流式细胞术，其复杂性表现在哪些方面？
很多人将术语高复杂性流式细胞术（HCFC）与细胞仪可测量参数数量的简单增加混为一谈。在我看来，这个概念要复杂得多。当我们提及HCFC时，不仅仅指可检测的颜色数量，还涉及质量、自动化、分析工具、试剂和研究人员等多个方面。
开展HCFC意味着在这些方面均需进行优化，从而获取更完整、更准确、更高质量的检测结果。对我而言，这直接影响我病人的生活质量。
为何使用高复杂性流式细胞术？这项技术有哪些应用？
过去十年间，癌症免疫疗法经历了突破性变革。不仅在通过新单克隆抗体直接靶向表面肿瘤抗原如达雷妥尤单抗Daratumumab，或双特异性T细胞衔接器（BiTE）如贝林妥欧单抗Blinatumomab，而且在过继细胞疗法（ACT）领域，随着嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的发展或分子鉴定，克服抑制性免疫抑制的肿瘤细胞，都取得了重大进展。
流式细胞术的免疫表型分析在这些疗法中发挥着核心且非常有意义的作用。换言之，流式细胞术不仅可用于淋巴瘤和白血病的诊断和分类，还可用于治疗后微小残留病（MRD）的检测，以及研究患者的免疫反应，甚至可以用于治疗本身的进度控制，如监测患者回输后体内CAR-T细胞仍然存活的数量。
因此，医生和制药公司要求通过高灵敏度和更高质量检测获得更精准的结果。正如我前面提到的，为了实现这一点，有必要对HCFC的各个方面加以优化。
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什么是微小残留病（MRD）检测？流式细胞术如何应用于该类检测?
微小（可测量）残留病（MRD）是指治疗后体内残留的微量癌细胞。传统的诊断手段，比如免疫组化和形态学，检测灵敏度仅为10-2 - 10-3，无法可靠预测这些治疗后的无进展生存期（PFS）或总生存期（OS）。
病变细胞的鉴别能力可为临床反应和复发风险提供价值信息。MRD阴性与无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）延长显著相关。如果经适当验证和标准化，它可以作为临床试验中评估新疗法的替代性终点生物标记物。目前临床上对几种血液病MRD阴性的检测和结果的准确率越来越关注，比如多发性骨髓瘤的MRD检测程序已较完善。
目前，多发性骨髓瘤MRD监测依托灵敏平台，如定量等位基因特异性寡核苷酸聚合酶链反应（ASO-qPCR）、下一代测序（NGS）和多参数流式细胞术（MFC）。ASO-qPCR和NGS均具备高检测灵敏度（10-5 - 10-6），但与MFC相比，这些技术的适用性较低。传统MFC的检测灵敏度可轻松达到10-4, 但要满足评估MRD所需的高灵敏度，需要采集几百万个细胞，而传统免疫表型分析方案无法获得如此多的细胞数。为达到最低灵敏度10-5，现行共识指南对细胞数量的要求为至少两百万，并建议达到五百万。换言之，必须提高技术的特异度和灵敏度，才能获取更多细胞，以更有效地区分正常和异常浆细胞。
应用高复杂性流式细胞术将面临哪些挑战？
我认为，这些挑战主要存在于三个主要阶段。我们必须专注于染色、采集和分析过程的优化。当然，所有这些层面都必须引入质量符合标准的要素，就我而言，这些要素必须对临床诊断有效。
首先，如果我们针对样品染色流程的优化，我们首先想到的是引入自动化流程，以减少染色时间并避免人为失误。而HCFC的采用，使免疫表型分析组合设计变得愈加复杂，从而直接影响技术人员的试剂操作耗时。
再者，采集流程的优化，可能更直接地与高性能多参数流式细胞仪的开发相关，以便采集复杂组合。其数据处理能力也应更加强劲，而且为了方便质量控制，针对性能、校准、补偿和细胞仪间标准化过程的监测应更加简化。
最后，我们需要经验丰富的操作人员，以及可执行复杂分析策略、处理大量事件和参数的分析软件。
使用雪崩光电二极管（APD）代替光电倍增管（PMT）如何有助于所用技术的简化？
我在实验室使用CytoFLEX细胞仪进行肿瘤学、肺病学和肾病学实验室内的研究项目积累了丰富的经验。这款细胞仪的光子检测器采用雪崩光电二极管（APD），而非光电倍增管（PMT）。我对APD技术的使用体验非常满意。
首先，该仪器显示了荧光强度（MFI）和探测器增益设置之间良好的线性关系。从实用角度来看，调整增益时，软件可实时重新计算补偿溢出值。这使得我可以对增益设定值不同的组合使用相同的补偿实验。因此，相较于采用PMT检测器的传统流式细胞仪，使用该仪器无需额外花费时间进行补偿校准。
该仪器的另一大显著特点是高荧光灵敏度和低电子噪声。灵敏度代表低强度信号的测量能力，即鉴别同一样品中低表达和高表达细胞群的能力。当获取MRD研究所需的大量细胞数时，灵敏度至关重要，因为大量正常细胞群的抗原表达模式可能与罕见异常细胞群的表达模式重叠。
因此，为了更清楚地鉴别正常细胞和异常细胞，我建议采用高复杂性流式细胞术（HCFC），同时引入创新染色技术和基于APD技术的流式细胞仪。
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软件和特定检测参数的补偿如何帮助研究人员应用高复杂性流式细胞术？
我认为，目前对于大多数流式细胞仪的使用者而言，任何通过直观易用软件简化自动补偿的工具都不可或缺。开展高复杂性流式细胞术研究时更是如此，因为这种技术需要大量的多色组合，其中所有荧光的组合将生成一个大的补偿矩阵。
我们对DxFLEX评估发现13色补偿非常容易（我们通常使用8~10种颜色）。只需分别对待研究的每种荧光分别进行染色，使用自动补偿模块进行采集，然后设置软件计算补偿矩阵。该补偿矩阵可保存在补偿库中，可将补偿库与目录增益设置一起使用，在研究组合（panel）中创建任意设置组合。
除了简化工作流之外，这些功能还可为实验创建和细胞仪性能监测方面节省大量时间。
分析物特异性试剂（ASRs）如何应用于高复杂性流式细胞术？其应用有何重要意义以及会带来什么样的额外挑战？
目前，为确保实验结果的质量和可靠性，行政部门和卫生机构对质量控制法规和认证的要求愈加严格，实验室压力与日俱增。在这种情况下，甚至在公开招标中，获得IVD标识的设备和试剂已成为硬性要求。因此，我们面临的最大挑战之一是增加符合此类要求的试剂数量。因为，这些试剂除了有助于资格认证外，还可以最大限度减少内部验证次数，并提供可靠的实验结果，避免重复检测。
比如，拥有IVD标识的抗体可确保产品质量、串联荧光染料的高性能及批次间一致性，这些特征都是HCFC实验的重要指标。找到提供这些产品的最全品类制造商将使实验现状大为改观。
如何通过样品制备简化高复杂性流式细胞术？
要简化高复杂性样品的制备流程，可以将该过程自动化或采用预混干粉抗体试剂。
我们的实验室在研究项目中积累了大量贝克曼库尔特DURAClone预混干粉抗体试剂的使用经验。这些试剂管底部装有预混、干燥的单克隆抗体组合可减少手动操作时间，并最大限度减少加样错误。这些特性已帮助我们显著改进了实验室工作流程，而且由于减少了人为操作失误，成本也随之显著下降。
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在应对高复杂性流式细胞术挑战方面，贝克曼库尔特流式细胞术能够提供什么帮助？
在实验室日常工作中，我最关心的问题之一是在多发性骨髓瘤MRD研究中需要获得足够多的细胞数，使灵敏度达到10-6。DxFLEX的应用令我们达成了这一目标，我们的每次采集已经能够获得高达2500万个细胞数。
此外，借助13色panel设计，我们已经能够测试其最大配置，该配置提供更高的分析特异性和复杂度，同时减少每个研究组合（panel设计）的试剂管数量。
此外，还必须补充说明的是，由于我们在样品处理过程中使用DURAClone技术，在采集过程中使用DxFLEX软件中的自动补偿、标准化、日常QC和性能监控模块，使得工作流程得以优化。
我在另外一家公司就职期间，初次接触流式细胞仪。当我开始与贝克曼库尔特生命科学公司合作后，对于贝克曼的技术储备及其产品背后的高质量技能人才及科学技术支持，包括专业的员工培训和积极支持员工应用新技术的做法，令我备受鼓舞和震撼。
您如何看待高复杂性流式细胞术的未来发展趋势？
我相信，随着HCFC技术的不断发展，未来将需要继续开发新工具以进一步优化染色、采集和分析流程。在这方面，贝克曼库尔特生命科学公司正积极开发新产品，致力于为此类挑战提供针对性解决方案。例如，DURAClone技术优化了染色流程，DxFLEX等先进设备优化了采集流程。
然而，我认为最大的挑战之一将是数据处理。因为很快我们将能够胜任处理更多的样品和分析更多的参数。这将逐步推动我们向高维度单细胞分析的方向发展，而高维度单细胞分析在数据管理、数据可视化、结果再现性、计算能力和信息共享等方面同样存在重重挑战。
从这一角度而言，由于贝克曼库尔特收购了为流式细胞术分析提供云计算的Cytobank软件，因此，我对贝克曼库尔特的未来发展充满期待。Cytobank和Kaluza软件团队正在进行的新技术开发前景值得期待，我希望在将来的研究中使用到这些新工具。
读者从何处可以浏览更多行业信息和专业知识？
- 国际骨髓瘤工作组多发性骨髓瘤反应和微小残留病评估共识标准，Kumar S, Paiva B, Anderson KC, Durie B, Landgren O, Moreau P, et al. Lancet Oncol. (2016) 17: e328–46. doi: 10.1016/S1470-2045(16)30206-6
- 浆细胞骨髓瘤微小残留病分析和报告共识指南， Arroz M, Came N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, et al. Cytometry B Clin Cytom. (2016) 90:31–9. doi: 10.1002/cyto.b.21228
- 下一代流式实现多发性骨髓瘤微小残留病高灵敏度和标准化检测，Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, Garcia-Sanchez O, Böttcher S et al. 2017 Leukemia Oct;31(10):2094-2103. doi: 10.1038/leu.2017.29
- 下一代流式细胞术检测多发性骨髓瘤可测量残留病，Paiva B, Puig N, Cedena MT, Rosiñol L, Cordón L, Vidriales MB, et al. 2020 J Clin Oncol. Mar 10;38(8):784-792. doi: 10.1200/JCO.19.01231
- 贝克曼库尔特CytoFlexTM平台优化和表征实用指南， Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding KL. 2020 Cytometry part A. doi: 10.1002/cyto.a.23998
- 一种基于半导体增强生物纳米颗粒分析光散射灵敏度的新型流式细胞仪， Brittain GC, Chen YQ, Nartinez E, Tang VA, Tylre M R, Langlois MA, Gulnik. Sci Rep 2019 Nov 5;9(1):16039. doi: 10.1038/s41598-019-52366-4
Mª Joséfa Marco简介
Mª Joséfa Marco博士是西班牙巴伦西亚Dr. Peset医院血液科的血液病专家。在西班牙巴伦西亚大学取得医学学位后，在白血病和淋巴瘤免疫表型分析的流式细胞术诊断领域积累了丰富的经验。在血液学专科实验室里，她一直负责流式细胞术医疗保健工作，是引入改善患者护理必需技术改造的积极推动者。其研究方向是高复杂性流式细胞术在临床生物、诊断和微小残留病方面的应用，主要研究单克隆球蛋白病，还负责协助癌症和器官移植患者免疫状态的临床试验的设计和开发。
