CytoFLEX nano 纳米流式分析仪：纳米级流式细胞仪的前沿新技术
目标
- 常见分选术语的定义。
- 了解 0.5 滴和 1 滴包膜分选液滴之间的区别。
- 了解混合模式分选的优势。
简介
流式细胞分选仪可以从悬浮液细胞中检测到并且分离目标细胞群体。它们将灵敏的流式细胞分析与细胞分选装置相结合。分析组件通过表面或细胞内蛋白质的表达差异在来确定细胞身份。通过基于表达谱的分析或分选，还可以根据细胞的活化状态和蛋白质表达指纹更精细地划分细胞。一旦选择了目标群体，软件和分选装置就会将包含目标颗粒的液滴分选到目标接收器中。分选可以提供高纯度的细胞群，供下游用于各种检测，例如基因组学、过继细胞转移、培养、蛋白质组学和成像。
CytoFLEX SRT 是一种静电液滴流式分选仪。所使用的分选装置与使喷墨打印机工作的系统类似。在 CytoFLEX SRT 中，细胞在流动池中被检测后，会以液流的形式离开流动池。该液流从与流动池相关的振动晶体接收振动能量。这种振动使流分解成液滴，如图 1 所示。这种振动的频率是液滴形成的速度，这个值每天都会略有不同。一旦检测到目标的细胞，系统就会等待，直到该细胞出现在液流上最后一个附着的液滴中，然后液流会随着振动频率及时充电，这样液滴就会带着静电荷脱落，其余的液流会恢复到地电位。当带电液滴穿过一组带电板时，它会向带有相反电荷的电极板偏转并落入收集容器中。
图 1. 液滴形成的图示。请注意赫兹频率，这也是液滴形成的速率。最后附着的液滴位于红线正上方，是接收静电荷的目标液滴。
本应用说明重点介绍 CytoFLEX SRT 流式细胞分选仪上可用的不同分选模式。根据下游分析，分选可能具有不同的所需纯度或得率。这可以通过选择适当的分选模式来解决。本应用说明定义并描述了 CytoFLEX SRT 流式细胞分选仪上的不同分选模式。还将定义一些常见的分选术语。
常见分选术语
分选逻辑
布尔（例如 AND、OR 或 NOT）或区域和门的分层逻辑的组合，以确定事件是否为正（即分选所需的事件）。超出分选逻辑的事件被视为负事件。根据分选模式，负事件可被视为污染物，并可能导致正事件中止。区域是根据一个参数（直方图）或两个参数（点图）定义的。门是区域的布尔组合。分层门是从嵌套群体（群体中的群体中的群体）创建的。CytoFLEX SRT 创建布尔门和分层门。用户定义将哪个门应用于分选逻辑。
分选模式
给软件的命令，用于确定何时充电和偏转液滴。分选模式在确定分选细胞的最终得率和纯度方面起着至关重要的作用，这取决于污染物（非目标）与使用分选逻辑选择的目标颗粒的接近程度。
丢弃
符合分选逻辑要求但在分选保护带中存在干扰的液滴（即太近而无法根据分选模式进行分选）。这些丢弃的液滴通常会进入废液流，无法分选到。但是，使用 CytoFLEX SRT，这些液滴可以分选到替代分选管以进行培养、重新分选或进一步分析。
分选效率
衡量中止事件的数量。以百分比表示，计算公式为（已分选的滴数）/（已分选的滴数 + 中止的滴数）x 100%。百分比越高，分选过程中中止的事件越少。分选样本前处理优秀的单细胞悬浮液时，效率可达到 90% 以上。样本中的团块、较高的事件发生率和碎片都会降低效率。
回收率
根据报告的已分选细胞的估计数量，回收率是管中计数的百分比。可以通过多种方法进行估算，例如目视计数或使用绝对计数微球检测样本。
得率
根据起始样本中估计的细胞数量，产量是已分选并返回供下游使用的百分比。公式为得率 = ((收集管中的事件数 x 纯度)/(起始管中的颗粒总数 x 目标颗粒百分比)) x 100%。
分类分选模式定义
根据所需的输出，可以使用三种不同的模式对选定的群体进行分选。
富集模式
当回收率是分选的最重要方面时，使用丰富模式。使用丰富模式，所有正事件（即满足分选逻辑的事件）都将被分选。
- 当回收率比纯度更重要时使用。
- 所有分类分选逻辑事件都将被分类分选，无论被分类分选的液滴中或附近是否有任何负事件（即超出分类分选逻辑的事件）。
- 使用此模式不会因负面事件或硬件重合事件而出现中止，因此效率将始终为 100%。（已分选的液滴）/（已分选的液滴 + 中止的液滴）x 100%
- 提供最大的效率和回收率，但纯度最低。随着事件率的增加和接近液滴生成率，纯度会降低
纯度模式
当分选的纯度是最重要的方面时，使用纯度模式。与正事件非常接近的负面事件使对纯液滴进行分选的可能性不大，并且包含正事件的液滴将被发送到指示中止的流（例如废液或另一个分选位置）。当纯度比回收更重要时使用。
- 正在分选的液滴将仅包含符合分选逻辑的事件。
- 如果液滴包含负面事件，它将被中止。
- 如果相邻液滴的最近边缘（15%）包含任何污染事件，则主液滴将被中止。在 CytoFLEX SRT 中，此边缘百分比称为排序分选保护带，可根据需要调整为更严格。
- 随着事件率的增加，中止率也会增加，因为相邻液滴的主要边缘或近边缘很可能会发生负事件。
单细胞模式
当每滴只有一个正事件是分选的最重要方面时，使用单一模式。它最常用于单细胞应用（如单细胞克隆分选和组学应用）的平板分选。
- 每滴有一个正事件是单一模式的最重要方面。
- 回收率较低，但纯度仍然很高。
- 分选的液滴中只有一个正事件，没有负事件。
- 如果相邻液滴的最近边缘（15%）包含任何正事件或负事件，则主液滴将被中止。
- 随着事件率的增加，中止率也会增加，因为相邻液滴的主要边缘或近边缘很可能会发生正事件或负事件。
- 最常用于将单细胞沉积到板/载玻片中以进行克隆。
混合分选模式分选案例
使用纯化和富集模式分选
混合模式分选可以为您的分选实验提供高度的灵活性。一个例子是，分选需要富集稀有细胞亚群，而这些细胞群体因费用、样本稀缺性或其他的限制而不能丢失。我们将使用多色方案对细胞进行染色，并展示不同分选模式对分选细胞种群结果的影响。图 2 显示了未分选样本的染色。
图 2.分选前的样本分析 重构的冻干人类淋巴细胞，CYTO-COMP 细胞试剂盒（零件号 6607023）按照使用说明使用 DURAClone IM T 细胞亚群（货号 B53328）进行染色，数据在 CytoFLEX SRT 细胞分选仪上采集。使用 CytExpert SRT 软件绘制了各区域。显示了所有区域的人群统计数据，以便与分选后的人群进行比较。
CytoFLEX SRT 细胞分选仪已设置为富集 CD8+ T 细胞，图 3。与液滴生成速度相比，该样本现在可以高速运行，并最大限度地减少该群体的细胞损失。请注意，这种分选的高效率表明没有因中止而导致的损失。重新分析分选后的样本后，可以发现其纯度仍高于初始分选样本，但如果使用更严格的分选模式（例如 Purify），则纯度低于预期，图 4。
图 3. CD8+ 富集模式的试管分选统计。试管分选窗口显示了图 2 中所示样本的四种分选位置的设置。R1 位置设置为 CD8+ 细胞的富集模式。红色框分别表示零中止和 100% 分选效率。
图 4. CD8 富集细胞的分选后分析。分选后分析了 R1 分选位置接收的细胞。CD8+ 细胞已富集，占总细胞的 95.33%，而起始样本的富集率为 24.89%（图 2）。分选后的细胞仍含有 CD4+ 细胞。
在同一个实验中，研究人员希望效应细胞群具有高纯度。在这种情况下选择的分选模式是纯度，如图 5 所示。请注意此流中的效率较低。
图 3. CD8+ 富集模式的试管分选统计。试管分选窗口显示了图 2 中所示样本的四种分选位置的设置。R1 位置设置为 CD8+ 细胞的富集模式。红色框分别表示零中止和 100% 的分选效率。
图 5. 效应器纯度模式的试管分选统计数据。 试管分选窗口显示了图 2 中所示的样本的四个分选位置的设置。L1 位置设置为 CD4+ 效应器细胞的纯度模式。红色框表示与富集模式相比，此分选的效率统计数据较低。
重新分析分选产品（图 6）后，使用纯化模式分选的群体与使用富集模式分选的群体相比纯度非常高。然而，代价是分选总体效率较低，因为一些细胞因中止而丢失。当以更高的速度分选时，纯度和中止率之间的这种权衡变得更加明显，因为每秒事件数接近液滴生成率。/p>
图 6. 纯度分选后的效应细胞分选后分析。分选后分析 L1 流。CD4+ 效应细胞现在占总细胞的 98.21%，而起始样本的占 2.01%（图 2）。分选后的细胞不包含 CD8+ 细胞。
高速分选高纯度细胞群
我们之前已经表明，与液滴形成速度相比，以更高的速度进行分选会导致效率降低（即中止率更高）。在本节中，我们将展示通过使用混合模式分选，我们可以在一个流中将细胞群分选为高纯度，并将该流和其他分选流分选位置中的中止发送到另一个流。这样，中止事件原本会被丢弃的细胞可用于其他实验，而不是浪费掉。
图 7. T 细胞记忆分选前的样本分析。 按照使用说明和在 CytoFLEX SRT 细胞分选仪上获取的数据，用 DURAClone IM T 细胞亚群（部件号 B53328）对重组冻干人淋巴细胞 CYTO-COMP 细胞试剂盒（部件号 6607023）进行染色。使用 CytExpert SRT 软件绘制区域画门。显示所有区域的种群统计数据，以便与分选后种群进行比较。
下图显示的是图 7 中样本分析中 CD4 T 细胞记忆亚群的分选。所有三个目标种群均使用纯度分选模式，并将中止细胞发送到分选流位置 R2，图 8。
图 8. 纯度模式分选和中止细胞捕获的试管分选统计数据。试管分选窗口显示了四个分选位置的设置，如图 7 中样本所示。L2、L1 和 R1 位置设置为纯度模式，R2 设置为从其他三个流中捕获中止细胞。
只要四个分选位置中的一个未被使用，来自任何或所有其他流的中止液滴都可以被发送到此替代方案，从而实现目标群体的无损分选。图 9 显示了中止流的分选后分析。它代表了所有选定的事件，以及导致中止的不良污染物。
图 9. 中止细胞的分选后分析。 与图 7 相比，分选后分析的 R2 流位置显示所有门控区域中均发生了由中止液滴引起的事件。
成功秘诀
- 分选时，您需要平衡速度、产量和纯度。研究人员通常可以同时强调其中两个，而忽略另一个。
- 如果存在导致大多数中止的污染群体，则中止流可能有助于排除故障。重新分析中止流也可以显示门控策略中的缺陷。
- 中止流还可以保留感兴趣的群体，即使它受到污染。可以将此样本重新分选为所需的更高纯度。
- 请记住，您可以将中止流合并为一个流，也可以将它们分成单独的中止流。
- 富集分选没有中止。
摘要
CytoFLEX SRT 具有多种分选模式选项，允许研究人员根据具体情况对所需的目标富集水平进行高度控制。这种混合模式实用程序可以对有价值的群体进行无损分选。可以将群体分选为高纯度，同时保留中止事件以供重新分选或进一步分析。
仅供研究使用。不可用于诊断程序。
