用CytoFLEX SRT细胞分选仪进行单细胞分选

简介

细胞分选仪的一个非常有用的功能是能够将单个细胞分选到多孔板中。这些实验通常被称为“克隆”实验，因为它们通常用于从单个细胞生长为细胞群落来创建克隆细胞系。近年来，单细胞基因组学和转录组学的进步增，加了单细胞分选的使用。

在像 CytoFLEX SRT 这样的细胞分选仪中，使用布尔门逻辑或数据分析图上的逻辑门来定义所需事件。当分选到试管中时，通常会沉积数千个这样的细胞。对于像这样的多细胞分选，将细胞收集到单个试管中，分选逻辑被定义为实现所需的纯度并最大限度地回收分选细胞。如果分选的是空液滴，或者分选的是污染（非目标）细胞，对分选结果的总体影响很小。此种分选策略可能导致选择更具包容性的分选逻辑和/或门控策略。然而，当单细胞孔板分选时，空液滴或受污染的液滴的影响要大得多。每个孔实际上都是一个独立的分选事件。因此，特别是在单细胞基因组学研究中，每个空孔或受污染的孔都可能存在干扰。因此，在设置板分选时应考虑分选纯度与效率要求。虽然获取分选逻辑中针对的所有细胞仍然很重要，但预计会有一些损失。群体越稀少，或者分选到板中时，这种损失就越难以容忍。高孔板分选得孔率是可取的，原因有很多，例如通过计算每个孔的数量来节省塑料制品，以及节省与单细胞基因组学研究试剂相关的费用。

在本应用说明中，将重点介绍如何设置单细胞孔板分选实验、0.5 滴和 1 滴的使用，以及使用这些分选条件可能产生的结果。

设置单细胞分选

创建区域、门控和分选逻辑

所有分选实验都从样本数据分析开始。在本例中，在 CytoFLEX SRT 上运行少量细胞，数据很简单。转染了 GFP 的 HeLa 细胞。

图 1. 单细胞分选门控示例。 使用 FSC x SSC 图上画门将区分细胞与碎片。通过 SSC-H 和 SSC-A 之间的线性关系识别单个的非粘连细胞。然后根据表达水平定义目标细胞。

对于此实验，可以使用 3 个图和 3 个逻辑门定义目标分选细胞群体。在此实验中，目标细胞是GFP表达量最高的前20%的细胞。使用三个逻辑门最终定义此群体。首先，通过查看 FSC-A 与 SSC-A 区分细胞与碎片。对于不同的细胞类型，可能需要增加这些通道的增益，以有效地将细胞与小碎片或死细胞区分开。

对于所有分选实验，重要的是将双联体（彼此粘附的细胞）排除在分选逻辑之外。有几种方法可以实现这一点，在这种情况下，使用 SSC-A（测量的脉冲面积）与 SSC-H（测量的脉冲高度）的图。在这种方法中，单联体将在这两个参数之间具有非常紧密的关联。任何双联体都将具有相似的高度信号，但由于第二个细胞粘附在第一个细胞上，它们的面积信号将增加。在分析实验中，这可以防止由于 2 个细胞粘在一起而导致的细胞身份错误。在分选过程中，这可以防止分选粘附在所需细胞上的不需要的细胞或分选只需要 1 个细胞的 2 个细胞。

最后，在这个实验中，决定只对表达最高的 GFP 阳性细胞进行分选。绘制一个区域以包括荧光蛋白的高表达群体。最后，在门 P3 中包括表达 GFP 最高的细胞群。使用门统计数据，绘制该区域以包括荧光蛋白的前 20% 细胞群体。

设置孔板分选

CytoFLEX SRT 的自动设置工作流程已经完成了寻找稳定液滴形成和液滴延迟的工作。用户在定义逻辑和板布局之前校准板定位（有关更多信息，请参阅 CytoFLEX SRT IFU，第 5 章）。

为您的实验创建一个新分选管，然后单击板分选图标，见图 2。

图 2. 将管添加到实验。红色轮廓标识用于将管添加到实验文件的板分选图标。

图 3. 空白板布局。红色轮廓是用于将孔或一系列孔定义为样品孔的按钮。

将出现一个空白板布局，图 3。首先，指出您要分选到哪种培养基（板类型）。然后指出您希望孔板分选的方向，无论是从左到右按行、跨行、沿列向下还是跨列或行蛇形。

选择您希望存放细胞的所有孔。在这种情况下，我们将外孔留空。这通常在细胞培养实验中完成，因为外部孔在长期培养后会很快变干。可以根据实验需要将任何孔保持打开或填充。

图 4。完成的板布局。 板布局显示分配要分选的孔，以绿色表示。

命名分选组（自由文本）并为该组分配孔颜色。在本例中，我们将其命名为“GFP+”并将其分配为绿色，图 4。通过从分层门列表中选择、选择“单一”分选模式并分配所需的目标计数，定义要分选到指示孔中的群体。单击确定以接受。

单击“开始分选”后，板分选开始。可以通过选择“没有数据的重复管”并再次单击“开始分选”来以相同的设置运行多个板。可以通过定义单个孔或孔组将其他群体分选到空孔中。但是，每个孔只能分配一个分选逻辑。

分选信封

在将单细胞应用分选到板中时，一个重要的考虑因素是分选信封的大小。分选信封的大小考虑了细胞在液滴内的位置，以确定是否对细胞进行分选或中止，见图 5。它询问，“细胞将保留在所需的液滴中，还是将移动到前一个或尾随的液滴？”

图 5. 液滴分选信封图解。

0.5 滴和 1 滴分选信封的图解。细胞卡通图指示液滴中将在每个信封条件下进行分选的位置。

在分选保护图解（图 6）中，显示了使用单分选模式的两个信封的效果。1 滴信封表示，只要预测感兴趣的细胞位于液滴内的任何位置，并且上下液滴的前缘和后缘没有污染细胞，液滴就会被分选。然而，在此细胞进入液滴之前，它位于流动池中进行询问，然后进入层流。随着液滴之间的界面变窄，液滴开始脱落，变窄空间中的细胞可能会移动到尾随或前一液滴中，这取决于它们在液流中的位置，如果细胞移出带电液滴，则可能导致将空液滴分选到孔中。如果目标细胞不在预测的液滴中，则对空液滴进行分选会导致空孔。 CytoFLEX SRT 通过使用保护带来处理此问题，该保护带将中止具有相邻液滴边缘的污染物的细胞。

图 6. 分选保护带图示。

黑色矩形表示前一液滴和尾随液滴中 15% 的液滴面积，如果可能存在污染物，则会导致中止。左侧细胞将被分选，右侧细胞将被中止。

相比之下，0.5 液滴分选信封通过仅对预测目标细胞位于液滴中心 50% 的液滴进行分选来解决此问题。这降低了将空液滴分选到孔中的机会。在 CytoFELX SRT 中使用单细胞分选时，默认的分选范围是 0.5 滴。

在板分选过程中，使用 1 滴范围将产生两种可能的结果。中止率会降低，因此孔板分选得更快，目标细胞的损失更少。其次，由于一些孔接收到空液滴，整体孔板分选效率可能会下降。或者，当使用默认的 0.5 滴范围时，情况会相反。孔板分选速度可能会更慢，但整体孔板分选效率会更高。板效率和填充板的速度也会受到样品属性的影响，例如细胞大小、分选细胞率和目标细胞百分比。

• 校准板以确保液流击中目标非常重要，尤其是在添加新的分选介质输出时。

• 当完全填充板是最重要的时，建议使用默认的单模式 0.5 滴分选信封。

• 确认板校准只需很少的时间，并且可以确保液滴会击中目标孔。

• 板效率可以通过多种方式测量，例如 PCR 确认、多孔板成像或荧光显微镜中的视觉确认（如下图 6 所示）。

• 在低容量微孔板中，请注意板孔和液滴本身的体积。已分选的细胞可能会落在收集介质之外并干燥。此外，液滴中的鞘与细胞一起分选，因此当在低容量下对每个孔中的多个细胞进行分选时，鞘对总体积的贡献可能成为一个问题。

用 GFP 转染的 HeLa 细胞用单 0.5 分选模式进行分选，以蛇形方式跨行填充板。分选收集在玻璃载玻片上的小孔中。让细胞沉淀后，在低倍放大下拍摄图像以显示单个点中的单个细胞。图像代表来自 3 个不同实验载玻片的 33 个孔。每个实验的 1 个孔有 10 个细胞/孔（未显示图像）以允许显微镜光学聚焦。左栏为实验 1，中间栏为实验 2，右栏为实验 3。

CytoFLEX SRT 的单细胞分选模式使研究人员能够高度信任细胞计数的准确性并将铺板效率最大化。多种接收孔板选项，最高可支持 384 多孔板，采用垂直（不带电液滴）分选，并可选择记录索引分选数据。如何填充板以及在板中放置哪些群体的灵活选项使 CytoFLEX SRT 用户能够自定义板分选条件以满足其分选的需求。

仅供研究使用。不可用于诊断。