用CytoFLEX SRT分选稀有E-SLAM造血干细胞及其后续培养

目标

• 了解成年小鼠 E-SLAM 干细胞的分析和分选方法
• 了解稀有细胞分选的注意事项

干细胞生物学中的应用是细胞分选的常见场景之一，并且随着干细胞研究的不断深入，干细胞分选的应用也越来越广泛。干细胞分选的典型应用包括但不限于细胞培养后分离、用于克隆或基因组学的单细胞分离，以及从血液、骨髓或其他原代组织样本中分离干细胞。

在本应用示例中，展示了一种从成年小鼠骨髓中分离长期造血干细胞 (long term hematopoietic stem cells (HSCs)) 的方法。这些细胞能够通过称为自我更新的过程产生血液系统的所有细胞以及子代 HSC。分选程序首先使用已发布的细胞分型策略在活体单细胞上设置分选逻辑门，该策略包含约 60% 的功能性 HSC，通过单细胞移植测量 - CD150+CD48- EPCR+CD45+SCA1+。 1;2)

研究人员常常担心分选过程中细胞受损，导致细胞在体外的存活率低和/或扩增效果差。虽然体外测定不能作为保留完整干细胞功能的证据，但它们可用于证明从单个细胞产生多种成熟细胞类型。此外，这些测定可以提供稀有干细胞以单细胞纯度进行分选并具有明确功能读数的示例。

干细胞生物学以外的细胞生物学应用研究也经常要求从复杂混合细胞中分选稀有（<1%）群体，以实现各种实验需求。这些数据还为那些对稀有细胞分选感兴趣的人提供了支持，即 CytoFLEX SRT 细胞分选仪能够区分这些细胞并以高纯度的方式分离它们。

SLAM 标记和更具体的 E-SLAM 标记集可以分离高度富集的造血干细胞 (HSC) 群体 1；2。这种复杂性凸显了细胞分选器的几种性能属性。首先，分选仪需要高水平的光学灵敏度，以便对细胞群进行精细区分。除了这种灵敏度之外，还需要减少由于探测器光子计数不准确而导致的细胞群扩散。这些细胞在初始细胞悬浮液中的稀有性（约 0.004%）使得每个细胞都很有价值，因此研究人员想要培养菌落的每个孔都需要接收能够进行细胞分裂的细胞 3;4。

此处提供的数据旨在让其他人复制这项工作，并提供显示稀有细胞分选和分选后培养生长的示例数据。

实验概述

细胞分离和染色遵循以下出版物中建立的实验步骤：

Prospective isolation and molecular characterization of hematopoietic stem cells with durable self-renewal potential.2

Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.1

简而言之，小鼠被处死后，从两条后腿的胫骨、股骨和胸骨中分离出骨髓细胞，将骨骼在含有 2% 胎牛血清（FCS，Sigma 或 STEMCELL Technologies (SCT)）的 PBS（Sigma）中粉碎。样品通过 20μm 无菌过滤器过滤后再进行进一步处理。使用氯化铵（NH4Cl，SCT）进行红细胞裂解，并使用 EasySep 小鼠造血祖细胞富集试剂盒（SCT）通过磁分离富集 HSPC。 E-SLAM Sca-1+ 细胞通过流式细胞分选术 分离，如前所述 (Kent 等人，2009)，使用 CD45 BV421 (克隆 30-F11，Biolegend)、CD150 PE/Cy7 (克隆 TC15-12F12.2，Biolegend)、CD48 APC (克隆 HM48-1，Biolegend)、Sca-1 BV605 (克隆 D7，Biolegend)、EPCR PE (克隆 RMEPCR1560，SCT) 和 7-氨基放线菌素 D (7AAD) (Life Technologies)。

所有细胞分选均使用 CytoFLEX SRT 细胞分选仪遵循 Beckman Coulter 的设置、质量控制和补偿建议。采用偏转板分选法将细胞单独放入圆底 96 孔板的孔中，每个孔预装 100 至 200 μL 无血清培养基（SFM；Iscove 改良杜氏培养基，添加 10 mg/mL 牛血清白蛋白、10 μg/mL 胰岛素、200 μg/ml 转铁蛋白、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 [均来自 StemCell Technologies] 和 10−4 M β-巯基乙醇 [Sigma-Aldrich]）。然后目视检查每个孔以确定哪些孔只含有一个活细胞。